BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
LƯU THẢO LINH NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI
SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE)
TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU
LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Hà Nội, ngày 28 tháng 6 năm 2015
Tác giả luận văn
Lưu Thảo Linh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân.
Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy
giáo TS. Nguyễn Đức Bách người đã định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin được cám ơn chân thành TS. Nguyễn Hữu Đức và Th.S Phạm Thu
Giang, Bộ môn Công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều
kiện thuận lợi trong việc sử dụng các trang thiết bị, kính hiển vi huỳnh quang, máy
ly tâm trong quá trình tôi thực hiện luận văn tại Bộ môn.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô trong Khoa
Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam những người đã trực tiếp
1.1.1 Giới thiệu về vi thể 3
1.1.2 Vi thể và khả năng truyền tín hiệu giữa các tế bào 5
1.1.3 Sự tương tác của vi thể với các tế bào 5
1.1.4 Khả năng vận chuyển protein của vi thể 6
1.1.5 Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể 7
1.1.6 Tương tác giữa vi thể với màng tế bào đích 8
1.2 Nghiên cứu về sự hình thành vi thể ở tế bào 9
1.2.1 Sự hình thành và tiết của các vi thể 9
1.2.2 Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu 10
1.3 Vai trò sinh học của Ca
2+
12
1.3.1 Vai trò của Ca
2+
trong điều kiện sinh lý bình thường 12
1.3.2 Vai trò của Ca
2+
trong việc hình thành vi thể 14
Chương 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1 Đối tượng nghiên cứu 16
2.2 Phạm vi nghiên cứu 16
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv
2.3 Nội dung nghiên cứu 16
2.4 Phương pháp nghiên cứu 16
2.4.1 Chuẩn bịcác dung dịch và hóa chất 16
2.4.2 Chuẩn bị mẫu hồng cầu 20
2.4.3 Chuẩn bị tế bào hồng cầu mang Fluo-4 20
2.4.4 Xác định nồng độ Ca
3.6.3 Ảnh hưởng PMA và Ca
2+
nội bào đến sự hình thành vi thể 35
3.7 Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể 36
3.8 Xác định kích thước của vi thể 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Kích thước vi thể 37
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào 4
Hình 1.2 Sự tương tác giữa MV với tế bào thông qua hai cơ chế 8
Hình 1.3 Quá trình hình thành vi thể 12
Hình 3.1 Thang chuẩn Ca
2+
nội bào 24
Hình 3.2 Tế bào hồng cầu ở điều kiện sinh lý 25
Hình 3.3 Nồng độ Ca
2+
2+
35
Hình 3.15 Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 36
Hình 3.16 Kích thước của vi thể đo bằng máy Zetasizer Nano 37
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
Kí hiệu tắt Nội dung
AM Acetoxymethyl
Ca
i
2+
Ca
2+
nội bào
DMSO Dimethyl sulfoxide
ESCs Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells)
GFP Green fluorescent protein
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
LPA Lysophosphatidic acid
MV Vi thể (microvesicle)
miễn dịch hoặc gây độc tế bào hoặc chỉ áp dụng trong điều kiện in vitro. Chính vì
vậy cần thiết phải phát triển một hệ thống mới có khả năng mang DNA để chuyển
gene hiệu quả hơn.
Vi thể (microvesicle/MV) là những cấu trúc có nguồn gốc từ màng tế bào có
kích thước từ 100 nm-1 µm, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau
(Anderson et al., 2005, Barteneva et al., 2013). Nghiên cứu trong những năm gần
đây cho thấy trong điều kiện in vivo, vi thể có thể mang các phân tử như protein,
nucleic acid bao gồm DNA, mRNA và miRNA đến tế bào đích thông qua cơ chế
dung hợp màng (EL Andaloussi et al., 2013, Lee et al., 2011, van Doormaal et al.,
2009, Yuan et al., 2009). Chính vì vậy vi thể có vai trò quan trọng trong giao tiếp
giữa các tế bào và chuyển gene.
Vi thể có thể hình thành ở hầu hết các tế bào kể cả tế bào hồng cầu. Do tế bào
hồng cầu có số lượng rất lớn, có khả năng vận chuyển đi khắp các mô, tế bào trong
cơ thể và dễ dàng thu nhận do không phải nuôi cấy, vì vậy các vi thể có nguồn gốc
từ tế bào hồng cầu người có thể được dùng để mang axit nucleic và chuyển gene. Để
nghiên cứu khả năng mang DNA và chuyển gene của vi thể từ tế bào hồng cầu cần
xác định được các điều kiện để tạo thành các vi thể. Chính vì vậy, chúng tôi tiến
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2
hành đề tài “Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể
(microvesicle) từ tế bào hồng cầu” tập trung vào việc xác định các điều kiện ảnh
hưởng tới sự hình thành vi thể và thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu.
2. Mục đích nghiên cứu
- Xác định được các điều kiện để cảm ứng để hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu
- Phát hiện sự xuất hiện vi thể thông qua protein gắn huỳnh quang annexin V-FITC
- Xác định kích thước của vi thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3
gốc từ tiểu cầu, phần ít hơn có nguồn gốc từ các tế bào máu khác, mức độ MV từ
hồng cầu tăng lên trong quá trình của một số bệnh lý như bệnh sốt rét và bệnh tế bào
hình liềm (Barteneva et al., 2013). Đối với tế bào hồng cầu, những tế bào chưa
trưởng thành tiết ra exosome trong khi đó tế bào trưởng thành tiết ra các
microvesicle (Lee et al., 2011, de Vooght et al., 2013). Sự giải phóng vi thể từ tế
bào hồng cầu người cũng đã được phát hiện và được cho là có liên quan tới sự hình
thành các cục máu đông và sự loại bỏ các tế bào đang ở trạng thái apoptosis bởi đại
thực bào (Antwi-Baffour et al., 2010, Nguyen et al., 2011). Tuy nhiên, cơ chế hình
thành và giải phóng MV từ tế bào hồng cầu cũng như vai trò của chúng vẫn chưa
được làm sáng tỏ. Hình 1.1. Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào
Ba nhóm cấu trúc màng tiết ra từ tế bào: exosome; thể apotosis; vi thể.
MVB (Multivesicular bodies) – Thể đa túi. (Gyorgy et al., 2011)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5
1.1.2. Vi thể và khả năng truyền tín hiệu giữa các tế bào
Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy vi thể có nguồn gốc từ tiểu cầu tham gia
vào quá trình hình thành các cục máu đông. Sự mất đối xứng về phân bố của các
thành phần lipid màng và sự vận chuyển của phosphatydil serine (PS) từ lớp màng
trong ra màng ngoài là một tín hiệu để giúp các yếu tố tham gia vào quá trình đông
máu nhận ra và gắn (Cocucci et al., 2009, Ratajczak et al., 2006, Zwaal et al., 2004).
Những khiếm khuyết trong quá trình đông máu được phát hiện ở những bệnh nhân
mắc hội chứng Scott có liên quan đến rối loạn trong quá trình vận chuyển của các
thành phần phospholipid màng (Zwaal et al., 2004). Sau khi tiểu cầu được hoạt hóa,
vi thể được giải phóng khỏi màng tế bào đi vào huyết tương và tương tác với các
tương tự, còn gọi là exosomes, có khả năng mang enzyme 5′ exonucleotidase gắn
với các tế bào glioma (Trams et al., 1981). Các MV cũng vận chuyển lipids, proteins
và các axit nucleic (DNA, mRNA, miRNA, mtRNA) và vận chuyển chúng từ tế bào
này đến tế bào khác (Lee et al., 2011).
Một ví dụ về cơ chế giao tiếp giữa các tế bào thông qua MV được báo cáo
gần đây là sự vận chuyển trung gian qua MV của một thông điệp tế bào chết bằng
cách đóng gói caspase-1 (Sarkar et al., 2009). Hiện tượng này được tìm thấy rằng
nội độc tố bạch cầu đơn nhân kích thích gây ra sự chết tế bào của các tế bào cơ trơn
mạch máu bằng cách tiết MV có chứa caspase-1. Con đường cảm ứng apotosis
xuyên bào này phụ thuộc vào chức năng của caspase-1 trong các tế bào mục tiêu. Nó
cũng được đề nghị rằng MV có thể góp phần lây lan các tác nhân nhiễm trùng nhất
định chẳng hạn như virus suy giảm hệ miễn dịch người hoặc các prion (Fackler and
Peterlin, 2000, Fevrier et al., 2004). Dựa vào đặc điểm sinh học và chức năng của
các MV, gần đây các MV đã bắt đầu được nghiên cứu và sử dụng làm phương tiện
để vận chuyển thuốc, DNA hoặc protein tới các tế bào đích.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7
1.1.5. Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể
Epigenetics là lĩnh vực nghiên cứu để giải thích những biến đổi về mặt kiểu
hình mà không liên quan đến sự biến đổi về trình tự DNA trong genome. Có nhiều
cơ chế liên quan đến epigenetics trong đó có hoạt động của các dạng RNA khác
nhau (Holoch and Moazed, 2015). Trong quá trình đồng nuôi cấy hiện tượng truyền
thông tin giữa các tế bào khác nhau đã được phát hiện thấy. Gần đây người ta đã
chứng minh rằng các vi thể có nguồn gốc từ khối u có thể chuyển không chỉ các
nhân tố quyết định bề mặt tế bào mà còn cả mRNA của các tế bào khối u tới các tế
bào khác. Tương tự, Ratajczak và cs. (2006) đã chứng minh rằng vi thể có nguồn
gốc từ các tế bào gốc phôi chuột (embryonic stem cells -ESCs) có thể kích thích quá
trình tái lập trình (re-program) của các tế bào đích. Một số nghiên cứu về MV có
Hình 1.2. Sự tương tác giữa MV với tế bào thông qua hai cơ chế
Cơ chế thực bào (A) và cơ chế dung hợp màng (B)
Các yếu tố mô (Tissue Factors -TFs) thường phân bố trên bề mặt các vi thể
với chức năng kết dính với màng tế bào đích thông qua cơ chế liên quan đến P-
selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1). Cả hai yếu tố TFs và PSGL-1 đều có thể
tồn tại đồng thời trên bề mặt của vi thể và tế bào đích. Nghiên cứu sử dụng kháng
thể đặc hiệu để khóa PSGL đã làm giảm dung hợp tế bào (Del Conde et al., 2005).
Cho đến nay, các thụ thể phổ biến được biết nhiều nhất là CD40, CD62 và các
integrin (Kotowicz et al., 2000). Nghiên cứu cơ chế lựa chọn các phân tử để mang
của các vi thể và sự tương tác giữa các vi thể với màng tế bào sẽ rất hữu ích trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9
việc làm sáng tỏ quá trình truyền tín hiệu, điều hòa hoạt động gene và tương tác tế
bào (D'Souza-Schorey and Clancy, 2012).
Trong quá trình kết dính và dung hợp màng, Ca
2+
được coi là yếu tố rất quan
trọng tham gia vào quá trình tương tác này. Các nghiên cứu đã cho thấy, Ca
2+
liên
quan trực tiếp đến sự hình thành các vi thể cũng như kết dính tế bào (Nguyen et al.,
2011, Steffen et al., 2011). Ca
2+
hoạt hóa scramblase dẫn đến phá vỡ phân bố không
đồng đều của các thành phần lipid giữa hai lớp màng theo sau đó phosphatidyl
nội bào tăng lên (Hugel et al., 2005).
Sự hình thành các vi thể được bắt đầu bằng dấu hiệu màng tế bào phồng ra ở
một vài vị trí. Các vị trí phồng ra sẽ lớn dần cuối cùng tách khỏi màng tế bào. Quá
trình này phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ Ca
2+
nội bào, sự hoạt hóa của calpain và
việc tái sắp xếp lại cấu trúc của bộ khung nâng đỡ tế bào. Nhiều công bố cho thấy
phosphatidyl serine và một số protein nằm ở lớp màng ngoài của các vi thể. Ngoài
ra, các yếu tố stress, chẳng hạn stress bởi các chất oxy hóa mạnh, cũng cảm ứng
hình thành các vi thể ở nhiều tế bào dạng tế bào khác nhau (Lang et al., 2003,
Mandal et al., 2005, Nguyen et al., 2011).
1.2.2. Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu
Các thành phần của màng tế bào hồng cầu đóng vai trò quan trọng trong việc
hình thành và giải phóng vi thể, chính vì vậy xác định được vai trò của các thành phần
màng tế bào hỗ trợ rất nhiều cho việc giải thích cơ chế hình thành các vi thể. Màng tế
bào hồng cầu bao gồm một lớp phospholipid kép mà bị xuyên qua bởi các protein
xuyên màng (ví dụ như band 3, glycophorin A và glycophorin C, kháng nguyên liên kết
Rhesus). Gắn vào mạng lưới khung xương tế bào bao gồm α- Spectrin, β- Spectrin và
actin qua protein 4.1R, protein 4.2 và ankyrin. Các protein màng và protein bộ khung
xương tế bào hồng cầu có chức năng duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào và cũng để
tạo tính biến dạng và độ bền cơ học cho tế bào hồng cầu (Mohandas et al., 1980). Bên
cạnh đó, một số protein màng tế bào hồng cầu có chức năng vận chuyển. Ví dụ, glucose
transporter 1 (GLUT1) và aquaporin-1 điều khiển vận chuyển glucose và nước. Ngoài
ra, có nhiều kênh ion xuyên màng để điều hòa các gradient ion và trạng thái hydrate hóa
của các tế bào hồng cầu (Thomas et al., 2011).
Trong trạng thái nghỉ, các phospholipid màng tế bào hồng cầu được phân bố
bất đối xứng trên toàn lớp kép, có nghĩa là các phospholipid chứa choline trung tính,
như phosphatidyl choline và sphingomyelin, có ở mặt ngoài của tế bào hông cầu trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11
1.3.1. Vai trò của Ca
2+
trong điều kiện sinh lý bình thường
Ca
2+
đóng vai trò quan trọng trong sinh lý và sinh hóa của sinh vật và tế bào
vì Ca
2+
liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp tới các con đường truyền tín hiệu như
truyền xung thần kinh, vận động cơ và thụ tinh.
Trong tế bào, Ca
2+
được dự trữ trong một số bào quan như ti thể hoặc
mạng lưới nội chất. Mỗi loại tế bào, mô khác nhau có nồng độ Ca
2+
nội bào
khác nhau. Thông thường, trong một tế bào điển hình, nồng độ nội bào của Ca
2+
khoảng 100 nM, tuy nhiên ở tế bào hồng cầu người hàm lượng Ca
2+
nội bào rất
thấp từ 30 đến 60 nM, điều này có thể là do tế bào hồng cầu trưởng thành không
chứa bào quan (Tiffert and Lew, 1997, Tiffert et al., 1993). So với dịch ngoại
bào, nồng độ Ca
2+
thấp hơn khoảng 12.000 lần khi tế bào ở trạng thái nghỉ. Sự
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13
Cho đến nay, cơ chế phân tử cơ bản chính xác của sự tạo thành MV ở tế bào
hồng cầu vẫn còn chưa sáng tỏ hoàn toàn bởi vì có sự tham gia của rất nhiều yếu tố
liên quan, chẳng hạn như dòng Ca
2+
, các áp lực hoặc sự suy giảm ATP và các yếu tố
khác chưa biết có thể dẫn đến hình thành và giải phóng vi thể. Ngoài ra, việc phân loại
có chọn lọc các thành phần màng nhất định trong cấu trúc của vi thể cũng là một điều
bí ẩn cần giải thích. Mặc dù quá trình lưu trữ máu được cho là tương tự như sự lão hóa
tế bào hồng cầu trong cơ thể thì vai trò của các protein khung xương tế bào liên quan
đến sự hình thành vi thể vẫn có thể khác nhau trong điều kiện in vitro và in vivo. Hơn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14
thế nữa các kiểu hình thái khác nhau của tế bào hồng cầu cũng có thể liên quan hoặc
ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể là khác nhau. Chẳng hạn, mặc dù hồng cầu của các
bệnh nhân bị hội chứng Scott có đồng thời hình thái bình thường và bất thường nhưng
không có sự khác biệt về thành phần khung tế bào của hai dạng tế bào này. Khi bị
kích thích với calcium ionophore A23187 sự hình thành vi thể xảy ra kém hiệu quả ở
các bệnh nhân này (Dasgupta et al., 2009). Như vậy, luôn có sự khác biệt về quá trình
hình thành và giải phóng vi thể từ tế bào hồng cầu, quá trình này phụ thuộc vào hình
thái tế bào và các yếu tố kích thích tác động lên tế bào.
Nồng độ Ca
2+
nội bào của tế bào hồng cầu trong các điều kiện sinh lý có thể
được đo bằng các phương pháp khác nhau thông qua các phức Ca
2+
hoặc quang phổ
nguyên tử hấp thụ hoặc đánh dấu huỳnh quang. Phương pháp xác định bằng huỳnh
quang rất phổ biến hiện nay. Các chất gắn đặc hiệu Ca
2+
của các thành phần phospholipid chính trong tế bào hồng cầu người có thể được
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 15
phát hiện bằng các kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang hoặc kiểm tra sự biến đổi các đặc
điểm vật lý của màng (Williamson et al., 1992, Romero and Romero, 1999).
Lysophosphatidic acid (LPA) là một dạng lipid trung gian quan trọng trong
các quá trình sinh lý bệnh khác nhau. LPA có thể kích thích mở một kênh vận
chuyển Ca
2+
trong tế bào hồng cầu người. Do đó, khi có mặt của Ca
2+
, LPA kích
thích dòng Ca
2+
đi vào tế bào và hệ quả dẫn đến phosphatidyl serine bộc lộ trên lớp
màng ngoài của tế bào, quá trình này có thể dẫn đến hình thành vi thể (Nguyen et
al., 2011).
Các caspase là những cysteine proteinase đặc hiệu với aspartate tồn tại như
các enzyme tiền thân tiềm ẩn nhưng một khi được kích hoạt bởi các tín hiệu tự chết
của hồng cầu, chúng thúc đẩy quá trình này bởi sự phân giải hạn chế đặc hiệu các
protein của các tế bào chất chủ chốt. Trong các điều kiện sinh lý, các procapscapse
có mặt trong tế bào hồng cầu trưởng thành. Sự tăng đột ngột Ca
2+
nội bào cũng kích
hoạt của caspase liên quan tới ức chế hoạt động của aminophospholipid flippase dẫn
tới hình thành vi thể (Mandal et al., 2005, Orrenius et al., 2003)
2+
nội bào
- Xác định ảnh hưởng của Ca
i
2+
đến sự hình thành vi thể
- Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể
- Xác định kích thước của vi thể
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Chuẩn bị các dung dịch và hóa chất
a) Dung dịch đệm sinh lý: NaCl 140 mM, KCl 7.5 mM, HEPES (4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 10 mM, Glucose 10 mM (chuẩn pH
= 7,4 bằng NaOH 0,1 M).
b) Annexin Binding buffer: Đệm phosphate (PBS) 10 mM, CaCl
2
2 mM
(chuẩn pH 7,4).
c) Dung dịch Heparin: Heparin được sử dụng để chống đông máu với hàm
lượng 25 U/mL máu hoặc 0,01 - 0,1 mL heparin/mL máu.
Copyright: Tài liệu đại học ©