BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT LÝ HÓA TÍNH VÀ MẬT SỐ
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM, VI KHUẨN HÒA TAN LÂN
TRONG ĐẤT XÁM TRỒNG BẮP Ở MIỀN
ĐÔNG NAM BỘ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
GS.Ts CAO NGỌC ĐIỆP LÝ HOÀNG THÂN
MSSV: 3102864
LỚP: CNSH K36
LỜI CẢM TẠ


Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cha mẹ - những người đã có
công sinh thành, nuôi dưỡng và dạy dỗ con đến ngày hôm nay.
Chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo cùng tất cả quý thầy cô Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu, trao dồi
kiến thức trong 4 năm qua.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn – GS. Ts Cao Ngọc Điệp đã
dìu dắt, tận tâm chỉ dẫn trong suốt thời gian học tâp cũng như trong quá trình thực
hiện thí nghiệm và viết luận văn.
Cám ơn chị Trần Thị Giang – cán bộ phòng thí nghiệm và các anh, chị, em
trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường – Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học cùng tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đã nhiệt tình giúp đỡ,
động viên và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian học tập cũng như lúc
thực hiện luận văn.
Cuối lời, xin kính chúc Cha Mẹ, quý Thầy Cô và các anh chị dồi dào sức khoẻ,
thành công và hạnh phúc, chúc tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đều hoàn
thành luận văn xuất sắc.

i

TÓM LƯỢC

Khảo sát một số lý hóa tính đất bao gồm các chỉ tiêu pH, hàm lượng chất hữu
cơ, lân hữu dụng, đạm tổng số nhằm hiểu thêm về thổ nhưỡng về vùng đất ở Đông

LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT i
MỤC LỤC … ii

DANH SÁCH BẢNG V
DANH SÁCH HÌNH VI
TỪ VIẾT TẮT………… …………… ……………………………………………VII
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lược về cây Bắp 2
2.1.1. Đặc điểm hình thái 2
2.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây bắp 2
2.1.3. Tình hình trồng bắp ở nước ta 3
2.2. Sơ lược về đất ở Đông Nam Bộ 3
2.3. Quá trình cố định đạm sinh học 4
2.3.1. Quá trình cố định đạm (cố định nitơ phân tử) 4
2.3.2. Các loài vi sinh vật tham gia quá trình cố định đạm 5
2.4. Quá trình chuyển hóa lân trong đất 8
2.4.1. Đối với lân hữu cơ 8
2.4.2. Đối với lân vô cơ 9
2.4.2.1. Sự chuyển hóa lân ở đất chua 9
2.4.2.2. Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm 10
2.4.3. Các vi sinh vật chuyển hóa lân 10
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12
iii

3.1.1. Thời gian nghiên cứu 12

4.3.1.4. Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và lân hữu dụng 27
4.3.2. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với các chỉ tiêu hóa lý
của đất. 28
4.3.2.1. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với pH 28
4.3.2.2. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với đạm tổng số 29
4.3.2.3. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với chất hữu cơ 30
4.3.2.4. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với lân hữu dụng 31
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32
5.1. Kết luận 32
5.2. Đề nghị 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC v

DANH SÁCH BẢNG


Hình 2: Vi khuẩn Sinorhizobium meliloti 6
Hình 3: Vi khuẩn Rhizobium và nốt sần rễ 6
Hình 4: Vi khuẩn Azotobacter sp. 8
Hình 5: Vi khuẩn Clostridium sp. 8
Hình 6: Vi khuẩn Bacillus megaterium 11
Hình 7: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 11
Hình 8: Pha loãng và nhỏ giọt trong phương pháp đếm sống nhỏ giọt 16
Hình 9: Hàm lượng đạm tổng trong các mẫu đất khảo sát……………………… 20
Hình 10: Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các mẫu đất khảo sát……………… 21
Hình 11: Mật số vi khuẩn hòa tan lân trong các mẫu đất khảo sát………………… 22
Hình 12: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với pH…………………… 23
Hình 13: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng đạm tổng số ….24
Hình 14: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng chất hữu cơ ….25
Hình 15: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng lân hữu dụng …26
Hình 16: Tương quan mật số vi khuẩn hòa tan lân với pH………………………… 27
Hình 17: Tương quan mật số vi khuẩn hòa tan lân với chất hữu cơ…………………28 vii

TỪ VIẾT TẮT

cfu: Colony Forming UnitVK: Vi khuẩn

Cđđ: cố định đạm

ĐNB: Đông Nam Bộ

đạm tổng số,…
Đất vùng Đông Nam Bộ do tập quán canh tác cũng như những điều kiện khí
hậu, thổ nhưỡng càng làm nhanh quá trình bạc màu của đất. Vì vậy, để tìm hiểu rõ
hơn vùng đất Đông Nam Bộ về tiềm năng vi sinh vật có ích bản địa nên đề tài được
thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ bắp của
các tỉnh Đông Nam Bộ.

Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1. Sơ lược về cây Bắp

2.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây bắp (Zea mays L.) thuộc họ Hòa Thảo, là loại cây hằng niên, thân bắp
thẳng, có nhiều lóng, thường cao 2–3m, lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100cm và

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2.1.3. Tình hình trồng bắp ở nước ta
Bắp là cây lương thực đứng thứ 2 sau lúa gạo nhưng vẫn chưa được chú trọng
nhiều do truyền thống canh tác lúa nước (Ngô Hữu Tình, 2009).

Sản lượng bắp ngày
càng tăng, năm 2012 đạt 4,81 triệu tấn, tăng nhẹ so với năm 2011 (4,65 triệu tấn).
Diện tích trồng bắp năm 2012 đạt 1,12 triệu ha, cao hơn so với năm 2011 (1,08 triệu
ha). (nguồn: www.agroviet.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/ /Baocao, ngày
23/7/2013).
Tuy nhiên sản lượng trên vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước để sản xuất
thức ăn chăn nuôi, thực phẩm và 1 phần sản xuất bia.
2.2. Sơ lược về đất ở Đông Nam Bộ
Vùng Đông Nam Bộ gồm các tỉnh, thành phố: Tây Ninh, Bình Dương, Bình
Phước, Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh và Bà Rịa- Vũng Tàu, diện tích tự nhiên khoảng
2,34 triệu ha.
Trong phạm vi của vùng, hai nhóm đất có diện tích lớn nhất là đất xám chiếm
44 % tổng quỹ đất của vùng, nhóm đất đỏ vàng chiếm 32 % trong đó đất đỏ bazan
chiếm 215 nghìn ha (chiếm 29 %, của nhóm đất đỏ vàng). Các nhóm đất khác như đất
cát, đất mặn, đất phèn… chiếm 14 %.
 Nhóm đất xám có tổng diện tích 1.038 nghìn ha, phân bố chủ yếu ở các
tỉnh, thành: TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Tây Ninh và Bình Phước.
Đất xám có các loại: Xám bạc màu trên phù sa cổ, xám bạc màu glây trên phù sa cổ và
xám bạc màu phát triển trên sản phẩm phong hóa của đá macma axit và đá cát.
 Đất đen nhiệt đới có diện tích là 49 nghìn ha, phân bố chủ yếu ở tỉnh
Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng Tàu. Đất có chất lượng khá tốt, thích hợp cho những loại
cây: bắp, đậu đỗ, mía và các loại cây ăn quả, bao gồm các loại đất: Đất nâu tím trên đá
macma bazơ và trung tính, đất nâu đỏ trên đá macma bazơ và trung tính, đất nâu vàng
trên đá macma bazơ và trung tính, đất đỏ vàng trên đá sét và biến chất, đất vàng đỏ


Đất nâu tím trên đá macma bazo và trung tính. 831

Đất nâu đỏ trên đá macma bazơ và trung tính 215.000

Đất nâu vàng trên đá macma bazơ và trung tính 152.000

Đất đỏ vàng trên đá sét và đá biến chất 109.000

Đất vàng đỏ trên đá macma acid 53.000

Đất vàng nhạt trên đá cát 7.600

Đất đen nhiệt đới

Đất nâu vàng trên phù sa cổ 207.000

(*nguồn:http://vaas.vn/kienthuc/cayngo,ngày 23/7/2013)
2.3. Quá trình cố định đạm sinh học
2.3.1. Quá trình cố định đạm (cố định nitơ phân tử)
Quá trình cố định nitơ phân tử (N) là quá trình đồng hóa nitơ của không
khí thành đạm amon dưới tác dụng của một số vi sinh vật có enzyme nitrogenase.
Nguồn nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên là nguồn khí nitơ tự do (N
2
) trong khí
quyển. Chúng chiếm tỉ lệ rất cao trong không khí (78%) (Dobereiner, 1987). Tổng số
nitơ trong cả khí quyển tới 41,015 tấn. Trong khí nitơ, hai nguyên tử nitơ liên kết với
nhau bằng 3 liên kết rất bền vững. Năng lượng của 3 liên kết này cao tới 225kcal/M.
Chính vì vậy mà N
2

Các vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh được gọi chung là Rhizobium chúng thuộc
bộ Rhizobiales, bao gồm 12 chi và 57 loài. Có 5 chi quan trọng trong nông nghiệp nhờ
đặc tính cộng sinh trên cây (Phạm Văn Kim, 2000):
 Rhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm R. arachis (cộng sinh
trên đậu phộng), R. etli (cộng sinh trên các loại đậu), R. gallicum (cộng sinh trên các
loại đậu), R. hainanense (cộng sinh trên các loài đậu nhiệt đới), R. huautlense (cộng
sinh trên điền thanh), R. indigoferae (cộng sinh trên cây chàm indigo),
R.leguminosarum (cộng sinh trên các loại đậu), R. phaseoli (cộng sinh trên các loại
đậu ve, đậu xanh).
 Bradyrhizobium (họ Bradyrhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm B. betae
(cộng sinh trên củ cải đường), B. canariense (cộng sinh trên các cây họ đậu, chịu được
đất chua), B. japonicum (cộng sinh trên đậu nành), B. lupine (cộng sinh trên đậu
lupin).
 Mesorhizobium (họ Phyllobacteriaceae): Các loài quan trọng gồm M. huakuii,
M. septentrionale và M. temperatum (cộng sinh trên các loại đậu đồng cỏ), M. loti
(cộng sinh trên sen), M. amorphae, M. mediterraneum và M. tianshanense (cộng sinh
trên đậu chickpea), M. plurifarium (cộng sinh trên các loài keo).
 Sinorhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm S. abri (cộng sinh
trên các loại đậu nhiệt đới, điên điển), S. americanus và S. terangae (cộng sinh trên
các loài keo), S. aroris (cộng sinh trên các loại đậu của Phi châu), S. medicae và
S. meliloti (cộng sinh trên cỏ alfalfa), S. saheli (cộng sinh trên thân điên điển, điền
thanh), S. xinjiangense (cộng sinh trên các loại đậu ở Trung Quốc).
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6


(Vasuvat et al., 1986)… Ở Việt Nam, thí nghiệm của Nguyễn Thị Phương Tâm (2006)
ở Cù Lao Dung, Sóc Trăng cũng cho thấy dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum
HA28 làm tăng năng suất 6,6 lần so với đối chứng không bón đạm, không chủng vi
khuẩn.
 Vi khuẩn Azotobacter. Năm 1901, Beyjeirick đã phân lập được từ đất một loài vi
sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử cao, ông đặt tên cho loài này là Azotobacter.
 Vi khuẩn Beyjerinckii. Nhà bác học Ấn Độ Stacke (1893) đã phân lập được một
loài vi khuẩn ở ruộng lúa nước pH rất chua có khả năng cố định nitơ phân tử và ông
đặt tên là vi khuẩn Beyjerinckii.
 Vi khuẩn Clostridium. Loài vi khuẩn này được Vinogratxkii (1939) phân lập đầu
tiên (Lê Xuân Phương, 2005).
 Ngoài các vi khuẩn trên, còn có rất nhiều loài có khả năng cố định nitơ sống tự
do như:
+ Xạ khuẩn: Một số loài thuộc giống Streptomyces, Actinomyces, Frankia,
Nocardia, Actinopolyspora, Actinosynoema…
+ Các vi khuẩn quang tổng hợp: Chromatium, Rhodomicrobium,
Rhodopseudomonas, Rhodospirillum…
Các tảo lam: Anabaena, Anabaenapsis, Calothris, Nostoc, Tolvcothrix… (Phạm
Văn Kim, 2000).
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Nhiệt độ cao cũng thuận lợi cho việc khoáng hóa lân hữu cơ, thích hợp là từ
45-50
o
C. Do đó, mùa hè tốc độ khoáng hóa lân nhanh hơn các mùa khác.
2.4.2. Đối với lân vô cơ
Sự tồn tại các loại ion phosphate tùy thuộc vào pH đất. Do vậy thực tế trong
đất, lân tồn tại chủ yếu ở 2 dạng: H
2
PO
4
-
và HPO
4
2-
H
2
PO
4
-
HPO
4
2 -
PO
4
3-

Dung dịch acid dung dịch kiềm
Ở pH=7 tỷ lệ 2 ion này bằng nhau. H
2
PO

2
PO
4

Không tan
Ở các loại đất rất chua thì quá trình này càng diễn ra mạnh khiến H
2
PO
4
-
chỉ
còn lượng rất nhỏ trong đất.
Trong môi trường chua còn 2 quá trình cố định lân liên quan đến sét. Đó là do
sự tồn tại các ion OH- trên bề mặt khoáng sét.
Sét - OH + Ca(H
2
PO
4
)
2
sét - H
2
PO
4
-
+ 1/2Ca(OH)
2

Khả năng cố định thay đổi theo bản chất khoáng vật của keo sét theo thứ tự:
Illit > Kaolinit >Montmorillonit.

4
.2H
2
O +H
2
O
6CaHPO
4
.2H
2
O + 2CaCO
3
+ H
2
O Ca
8
H
2
(PO
4
)
6
.5H
2
O + 2CO
2

Ca
8
H

Nhiều vi khuẩn như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus
butyricus, Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn vùng rễ, xạ
khuẩn có khả năng phân giải Ca
3
(PO
4
)
2
và bột apatit. Khả năng phân giải lân vô cơ
liên quan mật thiết đến tự sản sinh acid của vi sinh vật. Quá trình lên men tạo acid
carbonic là acid chủ yếu thúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ.
Ca
3
(PO
4
)
2
+ H
2
CO
3
+ H
2
O Ca(PO
4
)
2
.H
2
O + Ca(HCO

)
2
+ 2Ca(NO
3
)
2
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 2H
2
SO
4
Ca(H
2
PO
4
)
2
+ 2CaSO
4
Đối với nấm thì Aspergillus niger cho khả năng phân giải lân mạnh nhất, ngoài
ra còn 1 số chủng khác như Penicilin, Rhizopus,…
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT



CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Đất vùng rễ cây bắp được thu từ các tỉnh: Bà Rịa- Vũng Tàu, Bình Phước, Tây
Ninh, Đồng Nai.
3.3. Phương tiện nghiên cứu
Sử dụng thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường,
phòng Khử trùng của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ.
3.3.1. Thiết bị
Cân điện tử.
pH kế.
Tủ cấy vô trùng.
Nồi khử trùng nhiệt ướt.
Tủ ủ.
Tủ sấy.
Máy vortex.
Máy lắc mẫu.
3.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
Bình tam giác 250ml, bình tam giác 100ml, nút gòn, nắp giấy.
Ống nghiệm, nút đậy ống nghiệm.
Đĩa petri, cốc thủy tinh
Micropipette, đầu cole.
Và một số dụng cụ khác.

4
.7H
2
O
 FeSO
4
.7H
2
O
 NaMoO
4
.2H
2
O
 Agar
10 g/l

0,41 g/l

0,52 g/l

0,05 g/l

0,2 g/l

0,1 g/l

0,005 g/l

0,0025 g/l

hoặc Apatide
 Bromothymol Blue
 Agar
10 g/l

0,1 g/l

0,25 g/l

0,5 g/l

0,2 g/l

5 g/l

0,5%(w/v)

20 g/l

Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


sau đó chuẩn độ lượng dư K
2
Cr
2
O
7
bằng FeSO
4
0,1N.
3.4.1.3. Hàm lượng lân hữu dụng
Hàm lượng lân hữu dụng được xác định bằng phương pháp Oniani, lân hữu
dụng được lôi cuốn bằng acid loãng 0.1N và xác định hàm lượng bằng máy đo quang
phổ hấp thụ ở bước sóng 880nm.
3.4.1.4. Hàm lượng đạm tổng số
Sử dụng phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng nitơ tổng trong đất (N-
amoni, N- nitrat và N- trong các hợp chất hữu cơ).
3.4.2. Khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân
Thí nghiệm được tiến hành nhằm kiểm tra, đánh giá mật số của hai loại vi
khuẩn có lợi là cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ bắp ở các tỉnh Đông Nam
Bộ. Mật số vi khuẩn cố định đạm được xác định trên môi trường Burk’s và vi khuẩn
hòa tan lân trên môi trường NBRIP.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại. Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


ở
ống nghiệm thứ ba.
- Nhỏ giọt:
+ Chuẩn bị 6 đĩa môi trường(3 đĩa môi trường Burk, 3 đĩa môi trường
NBRIP) ứng với mỗi mẫu (tức là mỗi môi trường lặp lại 3 lần), mỗi đĩa được chia làm
3 phần đều nhau ứng với 3 độ pha loãng 10
3
, 10
4
, 10
5
. Ở mỗi phần đĩa, tiến hành nhỏ 5
giọt mẫu đã pha loãng ứng với nồng độ pha loãng ở phần đĩa đó.
+ Sau khi trộn đều mẫu đã pha loãng chứa trong các ống nghiệm bằng máy
Vortex, dùng micropipet hút 10 µl dung dịch mẫu và nhỏ thành một giọt trên đĩa petri
tương ứng với nồng đã đánh dấu trên đĩa, nhỏ 5 giọt/1 phần đĩa. Nhỏ những giọt gọn,
nhẹ sao cho từng giọt tỏa tròn, đều, các giọt có cùng độ pha loãng đều nằm trong 1
phần và không dính nhau. Ủ ở 30
0
C, sau 24 - 48 giờ bắt đầu đếm số khuẩn lạc hình
thành.