TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LÊ KIM THANH

ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ
LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC
CỦA ENZYME BROMELAIN TRONG QUẢ DỨA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08
Người hướng dẫn
TRẦN THANH TRÚC
NĂM 2007
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang ii
Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài :” Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên
hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa” do Lê Kim Thanh thực
hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.

Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện

Trần Thanh Trúc Nguyễn Thị Thu Thủy


Em xin chân thành gửi lời cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến:
Cô Trần Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận
lợi nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp;
Và cô Nguyễn Thị Thu Thủy đã nhiệt tình truyền thụ những kiến
thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong quá
trình thực hiện đề tài;
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm Công Nghệ
Enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã
nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề
tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực
Phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những tri thức quý báu cho
chúng em trong suốt thời gian học tập.
Em xin cảm ơn thầy cố vấn Nhan Minh Trí và tập thể các bạn lớp
Công Nghệ Thực Phẩm khóa 28 đã động viên và giúp đỡ em trong
suốt khóa học vừa qua.
Cần Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007
Sinh viên thực hiện
Lê Kim Thanh
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang i
TÓM TẮT
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ quả dứa, sự biến đổi của các thành phần và
giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thường xảy ra trong quá trình tiền xử lý. Bên cạnh đó,
sự tương tác giữa các thành phần bên trong nguyên liệu cũng có thể dẫn đến những
biến đổi không mong muốn như trên. Một trong những nguyên nhân gây ra điều này
đáng được quan tâm là hệ enzyme trong quả dứa mà tiêu biểu là hệ enzyme
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang ii
MỤC LỤC
TÓM TẮT ........................................................................................................... trang i
MỤC LỤC................................................................................................................... ii
DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................. iv
DANH SÁCH BẢNG................................................................................................. iv
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................... 1
1.1 TỔNG QUAN........................................................................................................ 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................................... 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................... 2
2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA................................................................................. 2
2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA........................................................... 3
2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa................................................................... 3
2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain ............................................................................. 4
2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính chung của enzyme bromelain.............................................. 5
i. Cấu tạo............................................................................................................. 5
ii. Hoạt tính enzyme bromelain............................................................................. 6
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain ................................ 7
i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ....................................................................... 7
ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH............................................................................... 8
2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME ............................................................. 9
2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản..................................................................... 9
2.3.2 Động học phản ứng enzyme.............................................................................. 10
2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN................................................................. 11
2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN........................... 12

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang iv
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến.................................................................................. 2
Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus).................................................................................... 3
Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain .....................................6
Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine ......................................................................... 6
Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pH
môi trường
lên hoạt tính enzyme........................... 8
Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly bromelain quả (thô) ............................................................ 16
Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1%........................................................................ 16
Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả theo thời
gian bảo quản....................................................................................................................... 21
Hình 9: Mẫu dung dịch chiết chứa enzyme bromelain quả sau 12 ngày bảo quản ................. 22
Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của
enzyme bromelain trong dịch quả dứa.................................................................................. 23
Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ
khác nhau............................................................................................................................. 24
Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ở
pH thấp................................................................................................................................ 25
Hình 13. Đường chuẩn tyrosine............................................................................................ vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein ................................................................. 12
Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính của enzyme bromelain trong dung dịch dứa tươi theo thời
gian bảo quản....................................................................................................................... 20
Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý lên
hoạt tính của enzyme bromelain quả .................................................................................... xii

Khảo sát tác động của việc xử lý pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme
bromelain quả trên cùng một loại cơ chất. Trên cơ sở đó, tìm hiểu được quy luật biến
thiên về hoạt tính của hệ enzyme này theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ chế biến
nhằm phục vụ cho công nghệ chế biến các sản phẩm từ dứa.

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 2
Ruộng dứa Dứa Queen
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA
Dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được đưa tới các đảo khu
vực Caribe nhờ những thổ dân Anhdieng Carib. Năm 1493, Christopher Columbus lần
đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe. Ông đã đem chúng về
Châu Âu và từ đây chúng được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên
Thái Bình Dương (Morrison, 1963). Năm 1813, các cánh đồng trồng dứa thương phẩm
được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba. Dứa đã trở
thành một trong 3 loại cây ăn quả phổ biến nhất trên thế giới, sau chuối và các loại quả
họ citrus (Anon, 1993).
Dứa có tên khoa học là Ananas comosus. Thuộc loài Ananas, họ Bromeliaceae. Một số
giống dứa trồng phổ biến nhất hiện nay là giống Queen và Cayenne, tên khoa học là
Ananas comosus (Linnaeus) merril (Brasil). Ngoài ra, còn có một số giống dứa ăn quả
phổ biến khác như Ananas sativus, Ananas bracteatur (Lindley) (Nam Mỹ).. (Collin et
al., 1931). Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến
Hiện nay, trên thế giới cây dứa được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới như
Philippines, Thái Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba, Nam Phi..và một số nước cận

acid phosphatase.
(Nguồn: http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/bromelain.html, truy cập ngày:
13/11/2006)
- Enzyme peroxidase, tồn tại và có hoạt tính không đổi trong suốt quá trình phát
triển của quả. Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này giảm dần, chỉ còn
khoảng 1/3 so với ban đầu (Gortner và Singleton, 1965).
- Cysteine protease là nhóm enzyme proteolytic chủ yếu nhất được tìm thấy trong
dịch thân và quả dứa. Protease trong quả xuất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần
về số lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả. Ở giai đoạn quả chín, lượng
enzyme này cũng có xu hướng giảm dần (Gortner và Singleton, 1965; Lodh et al.,
1972).
- Từ cây dứa loài Ananas, người ta đã tìm thấy được có tối thiểu 4 loại cysteine
protease khác nhau (Rowan et al., 1988). Protease hiện diện chủ yếu trong dịch từ
thân dứa là bromelain thân, ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 4
comosain. Trong dịch quả dứa, cysteine protease chủ yếu là bromelain quả.
- Từ một số nghiên cứu khác, các nhà khoa học còn tìm thấy trong dịch từ thân và
quả của một loại dứa Bromelia pinguin (cùng họ Bromeliaceae) cũng chứa
enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18). Loại này chỉ có một số đặc
tính đặc biệt và hoạt tính hydrolase kém hơn so với bromelain (Toro-Goyco et al.,
1968).
- Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa
học đã tìm thấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I. Loại enzyme
này cũng đã được xác lập vào nhóm cysteine protease (Bruno M.A.; Pardo M.F.;
Caffini N.O.; López L.M.I, 2003).
Trong quá trình phát triển của cây và trái dứa, dịch chiết thân và trái còn chứa một số
các enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase

thân.Tuy nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân tốt nhất trên cơ chất tổng hợp
Bz-Phe-Val-Arg+NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như
bromelain thân.
(Nguồn:http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes/ec3/ec04/ec22/ec0033/index.html, truy cập ngày:
13/11/2006)
Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31 kDa tùy
thuộc vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm. Bromelain quả có điểm đẳng điện
pI = 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et
al., 1985).
2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme bromelain
i. Cấu tạo
- Mã số enzyme
 Bromelain thân: E.C.3.4.22.32
 Bromelain quả : E.C.3.4.22.33
(Nguồn: http://www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33, truy cập
ngày: 21/12/2006)
- Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain
- Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease
- Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis), Bromelain 2400 Maximum
Strength (Vitalize Corp)
Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch
chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine.
Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có
chứa cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH
(sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân
tử có tất cả 5 cầu nối disulfite.
Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain
thân có khoảng 321 – 144 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 283 – 161 acid
amin. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain trong thân dứa cao hơn
bromelain trong quả xanh và quả chín.
R R
(- NH – CH – CO – NH – CH – CO - )
n

+ H - OH
Enzyme bromelain
n = k + i
R
( - NH – CH – COOH )
i

+ R
( H
2
N – CH – CO - )
k

Hình 4: Cấu trúc phân tử
proteases cysteine
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 7
- Đối với cơ chất tổng hợp như BAA, ở 5
0

0
C. Nhiệt
độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử
enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí
không gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất.
Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt
tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999).
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 8
pH tối thích
Độ hoạt
động của
enzyme
pH
pH
tối thích
Bên cạnh đó, nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc
biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động
làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn
tại của enzyme..
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy
- Ở dịch chiết quả, (pH = 3,5), khi tăng nhiệt độ lên đến 60
0
C thì bromelain vẫn còn
hoạt tính.
- Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn
 Ở 5
o

khoảng pH = 3 – 10. Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của enzyme bromelain lại là pH =
5 – 8. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Trong phân tử enzyme bromelain, trung tâm hoạt động là cysteine, chứa nhóm hóa học
hoạt động mạnh là – SH . Khả năng xúc tác của nhóm cysteine là nhờ liên kết đồng hóa
trị được tạo thành thioester giữa nhóm acyl của cơ chất và nhóm sulfuhydryl của gốc
cysteine.
Trong môi trường pH sinh lý (pH = 6 – 8), phần lớn các nhóm – SH ở trạng thái không
ion hóa và sự tạo thành liên kết hydro với cơ chất là do sự tham gia proton của nhóm
– SH . Chính nhóm proton – SH sẽ làm tăng mật độ điện tích xung quanh nguyên tử
lưu huỳnh (Lê Ngọc Tú, 2004).
Bên cạnh đó pH còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác, mức độ ảnh hưởng của pH môi
trường lên enzyme tùy thuộc vào nhiệt độ, loại cơ chất, thời gian phản ứng, độ tinh
khiết của enzyme, bản chất của dung dịch đệm và sự hiện diện của chất tăng hoạt.
2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME
Enzyme là một chất xúc tác sinh học đặc hiệu, có vai trò xúc tác các phản ứng sinh hóa
diễn ra trong cơ thể sống. Về cấu tạo, enzyme có bản chất là protein, trong phân tử
enzyme có một hoặc vài bộ phận mang tính chất đặc hiệu, chỉ có bộ phận này mới tham
gia xúc tác phản ứng. Bộ phận này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trong
trung tâm hoạt động, có những nhóm chức hóa học có chức năng trực tiếp trong quá
trình xúc tác phản ứng. Tất cả các phần còn lại của enzyme đóng vai trò như một cái
khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác của enzyme.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản
Tất cả các phản ứng sinh hóa đều có thể diễn ra với sự có mặt hay không có mặt
enzyme. Thông thường, các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất
tham gia phản ứng phải tiếp xúc với nhau ở vị trí tham gia phản ứng và chúng phải ở
trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hóa các phân tử này cần cung cấp cho chúng một mức
năng lượng nào đó đủ để đạt đến trạng thái hoạt hóa. Năng lượng đó gọi là năng lượng
hoạt hóa. Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự
tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn. Tức là đối với phản ứng có

-1
có giá trị nhỏ nhất.
Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất

K
2
tỉ lệ với nồng độ ES: v = K
2
.[ES] (v: vận tốc phản ứng)
Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua
ba giai đoạn:
 Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt
động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất
(E-S). Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết
yếu nên phức hệ E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy
ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết tham
gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết
phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Vander-Waals và liên
kết do dịch chuyển điện tử.
 Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất
sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên
trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia
ES E + P
K
2

E + S ES E + P
K
1

amonium..). Các muối caseinate thì bền với nhiệt và tan trong nước tốt hơn. Casein
trong sữa gồm bốn dạng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein.
(Lê Văn Việt Mẫn, 2004)
 α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine. Do sự
phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử
loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.
 α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính
ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm
phosphoryl và gốc cation nhất.
 β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa
béo cao nhất. Dưới 40C, β-casein hoàn toàn bị khử trùng hợp do có nhiều tương
tác ưa béo bị phá hủy.
 κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ
chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử
protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng
Trang 12
Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau thì có thể có cấu trúc bậc
một khác nhau. Tuy nhiên cấu trúc bậc một của cùng một loại casein chỉ khác nhau bởi
vài gốc acid amine trong phân tử protein của chúng (Lê Ngọc Tú, 2003).
Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein
Acid amine Tỉ lệ (%)
Glutamic Acid
Proline
Leucine
Lysine
Valine
Aspartic Acid

Nguồn: http://www.casein.com/products.htm, truy cập ngày: 16/12/2006

2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN
Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi về thành phần hóa học của bromelain
thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide,
tetra nitromethane và H
2
O
2
. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp
chất trên, enzyme bromelain bị biến đổi mạnh về cấu trúc, thành phần các acid amine
trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định.
(Nguồn: http://www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33, truy cập
ngày: 15/03/2007)