TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC
----------

TRẦN HOÀNG HẢI

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CAO METHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN ĐƢỢC
LY TRÍCH TỪ THÂN CÂY CỎ MỰC (Eclipta alba)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: SINH HỌC

Cần Thơ, 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC
----------

TRẦN HOÀNG HẢI

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CAO METHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN ĐƢỢC
LY TRÍCH TỪ THÂN CÂY CỎ MỰC (Eclipta alba)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: SINH HỌC


Cán bộ hướng dẫn

Tác giả luận văn

Ký tên

Ký tên

Võ Thị Tú Anh

Trần Hoàng Hải

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................



Sinh học k37

MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH................................................................................................... v
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ .................................................................... vi
TÓM TẮT ................................................................................................................... vii
1. MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2
2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................................... 3
2.1. Các khái niệm về dịch tễ học nhiễm trùng ..................................................... 3
2.1.1. Thực trạng ................................................................................................... 3
2.1.2. Sơ lƣợc về bệnh nhiễm trùng ..................................................................... 3
2.1.2.1. Nhiễm trùng và lây lan ......................................................................... 3
2.1.2.2. Bệnh nhiễm trùng trong cộng đồng nói chung và bệnh nhiễm trùng
bệnh viện ...................................................................................................................... 4
2.1.2.3. Bệnh nhiễm trùng nhanh và bệnh nhiễm trùng chậm ...................... 4
2.1.2.4. Bệnh nhiễm trùng ngoại sinh và bệnh nhiễm trùng nội sinh ........... 4
2.2. Một số vi khuẩn gây hại phổ biến ................................................................... 4
2.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli .......................................................................... 4
2.2.1.1. Hệ thống phân loại khoa học .............................................................. 4
2.2.1.2. Đặc điểm hình thái................................................................................ 5
2.2.1.3. Tính chất nuôi cấy ................................................................................ 5
2.2.1.4. Kháng nguyên ....................................................................................... 5
2.2.1.6. Dịch bệnh do E. coli gây ra .................................................................. 6
2.2.2. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ........................................................... 7
2.2.2.1. Hệ thống phân loại khoa học .............................................................. 7
2.2.2.2. Đặc điểm hình thái................................................................................ 7

3.1.2. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 17
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ..................................................................... 18
3.2.1. Địa điểm ....................................................................................................... 18
3.2.2. Thời gian...................................................................................................... 18
3.3. Hóa chất ............................................................................................................. 18
3.4. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................... 19
3.4.1. Xử lý nguyên liệu và điều chế cao tổng (methanol) ................................. 19
3.4.2. Điều chế các cao phân đoạn (hexane, chloroform, ethyl acetate) .......... 21
3.4.3. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao thân ly trích
từ cây cỏ mực (Eclipta alba) ....................................................................................... 24
3.4.3.1. Chuẩn bị môi trƣờng ............................................................................ 24
3.4.3.2. Pha loãng cao chiết ............................................................................... 24
3.4.3.3. Nhân mật số vi khuẩn........................................................................... 26
3.4.3.4. Khuếch tán trên thạch.......................................................................... 26
3.4.4. Thống kê phân tích số liệu ......................................................................... 26
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................ 27
4.1. Hiệu suất chiết cao ............................................................................................ 27
4.2. Đối chứng âm….. .............................................................................................. 28
4.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao thân cây cỏ mực với kháng
sinh thƣơng mại .......................................................................................................... 28
4.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng E. coli của các loại cao thân cây cỏ mực với
kháng sinh thƣơng mại.............................................................................................. 28

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37


DPPH
EMB
EMS/AHPNS
HUS
FRAP
LB
mm
PABA
PCA
SS
TCBS

micrometers
centimeters
Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh
Môi trường Desoxycholate Agar
1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl
Môi trường Eosine Methylene Blue
Hội chứng hủy hoại gan tụy cấp
Hội chứng tán huyết – tăng urê máu
Phương pháp chống oxy hóa bằng cách khử sắt Ferric
Reducing Antioxidant Power
Môi trường Luria – Bertani
millimeters
para-aminobenzoic acid
Môi trường Plate Count Agar
Môi trường Salmonella-Shigella
Môi trường Thiosulfate-Citrate Bile Salts

iv

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 4.1: Hiệu suất chiết cao của 3 bộ phận rễ, thân và lá cỏ mực ...................... 27
Bảng 4.2: Hoạt tính kháng E. coli của các loại cao thân với kháng sinh thƣơng
mại ................................................................................................................................ 28
Bảng 4.3: Hoạt tính kháng P. aeruginosa của các loại cao thân với kháng sinh
thƣơng mại .................................................................................................................. 31
Bảng 4.4: Hoạt tính kháng S. aureus của các loại cao thân với kháng sinh thƣơng
mại ................................................................................................................................ 33
Bảng 4.5: Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của các loại cao thân với kháng
sinh thƣơng mại .......................................................................................................... 35
Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu và điều chế cao methanol cỏ mực............ 20
Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các cao phân đoạn ................................................... 23

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

TÓM TẮT
Cỏ mực sau khi được thu hái ở huyện Cờ Đỏ, Thành phố Cần Thơ được tách lấy
phần thân, sấy khô và xử lý qua một số dung môi như methanol, hexane, chloroform và
ethyl acetate để có được cao tổng (methanol) và các cao phân đoạn. Hoạt tính kháng
khuẩn của các cao chiết được thực hiện trên các đối tượng: Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Vibrio parahaemolyticus ở 5

nước uống đóng chai và nước uống công ty không đạt chỉ tiêu lần lượt là 20% và 28%.
Trong số các chỉ tiêu vi sinh, Pseudomonas aeruginosa là chỉ tiêu nhiễm cao nhất,
chiếm đến 62% (Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2007).
Đứng trước thực trạng nhiễm khuẩn ngày một nghiêm trọng, nhiều người đã lựa
chọn kháng sinh như một giải pháp hàng đầu trong việc điều trị nhiễm khuẩn.
Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh vẫn còn tồn tại rất nhiều hạn chế như: phát sinh tác
dụng phụ, vi khuẩn dễ đột biến kháng thuốc, ô nhiễm môi trường,… làm mất lòng tin
người tiêu dùng. Nhận thức được mối nguy hiểm lâu dài kháng sinh mang lại, một số
hộ gia đình có xu hướng chuyển sang sử dụng thảo mộc thiên nhiên để điều trị nhiễm
khuẩn như nghệ, gừng, tỏi, cam thảo,… trong đó có cả cỏ mực.
Cỏ mực (Eclipta alba) là một loại cây phổ biến, mọc hoang ở nhiều nơi trên đất
nước. Theo kinh nghiệm dân gian, cỏ mực rất có hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh
nhiễm khuẩn. Mặc dù đã được sử dụng nhiều trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn
nhưng vẫn có rất ít bằng chứng khoa học cho thấy khả năng kháng khuẩn của các hợp
chất được ly trích từ cỏ mực.
1


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Việc chứng minh một cách khoa học tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất
được ly trích từ thân cây cỏ mực là cần thiết. Kết quả thí nghiệm nhằm góp phần làm
ổn định chất lượng sống của con người, đồng thời đưa nền y học dân tộc lên một tầm
cao mới.
Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO
METHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN ĐƢỢC LY TRÍCH TỪ THÂN CÂY
CỎ MỰC (Eclipta alba)” là một vấn đề mang tính cấp thiết trong cuộc sống hiện nay.
Từ kết quả mong muốn có được sẽ làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về khả


Chƣơng 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1

Các khái niệm về dịch tễ học nhiễm trùng

2.1.1

Thực trạng
Những tiến bộ to lớn của y học đã giúp chuẩn đoán và điều trị cũng như đề phòng

được nhiều bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên, bệnh nhiễm trùng vẫn chiếm vị trí quan trọng
ngay cả ở những nước công nghiệp phát triển. Đặc biệt ở các nước đang phát triển,
nhiễm trùng là nguyên nhân hàng đầu của bệnh tật, tử vong, … và cho đến nay, chỉ có
bệnh đậu mùa là bệnh duy nhất bị tiêu diệt trên Trái Đất. Thêm vào đó, các bệnh nhiễm
trùng mới xuất hiện ngày một nhiều, nguy hiểm, tính chất lây lan rộng rãi đưa loài
người vào nhiều tình huống khó khăn. Bệnh nhiễm trùng ở các nước đang phát triển
thường gắn liền với những tình trạng suy dinh dưỡng, văn hóa thấp kém và các hành vi
liên quan đến xã hội (Đinh Thanh Huề, 2006).
Sơ lƣợc về bệnh nhiễm trùng

2.1.2

Theo Đinh Thanh Huề (2006), có 4 khía cạnh để phân loại các bệnh về nhiễm
trùng là: nhiễm trùng và lây lan, bệnh nhiễm trùng trong cộng đồng nói chung và bệnh
nhiễm trùng trong bệnh viện, bệnh nhiễm trùng nhanh và nhiễm trùng chậm, nhiễm
trùng nội sinh và nhiễm trùng ngoại sinh.
2.1.2.1

Nhiễm trùng và lây lan

2.1.2.4

Nhiễm trùng ngoại sinh và nhiễm trùng nội sinh

Thông thường, vi sinh vật gây bệnh khi xâm nhập vào cơ thể ký chủ sẽ dẫn đến
tác động qua lại với đặc điểm là gây biến đổi cơ thể ký chủ: đó là trường hợp nhiễm
trùng ngoại sinh. Nhưng có khi sự xâm nhập này không dẫn đến hậu quả gây bệnh
ngay cho ký chủ, mà chỉ xảy ra sau một thời gian dài với sự hiện diện của vi sinh vật
một cách thụ động trong cơ thể ký chủ, thường gọi là nhiễm trùng nội sinh.
2.2

Một số vi khuẩn gây hại phổ biến

2.2.1

Vi khuẩn Escherichia coli

2.2.1.1

Hệ thống phân loại khoa học
Lãnh giới

Bacteria

Ngành

Proteobacteria

Lớp


E. coli là một trực khuẩn hình que ngắn, dài khoảng 6 µm và rộng 2-3 µm, tròn ở
hai đầu, tế bào thường đứng riêng lẽ nhưng đôi khi cũng xếp thành chuỗi ngắn, có tiêm
mao quanh thân nên có thể di động, rất ít chủng E. coli có vỏ. Vi khuẩn không có khả
năng sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Như Thanh and et al, 2007).
2.2.1.3

Tính chất nuôi cấy

E. coli là một vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý, dễ dàng phát triển trên các môi
trường nuôi cấy thông thường. Một số chủng E. coli có thể phát triển trên môi trường
tổng hợp nghèo dinh dưỡng. E. coli có thể sinh trưởng tốt ở 15-44ºC nhưng tốt nhất là
ở 37ºC. pH thích hợp cho E. coli phát triển thường giao động từ 5,5-8,5 nhưng tốt nhất
là ở mức 7,4 (Nguyễn Như Thanh and et al, 2007).
Trong điều kiện môi trường thích hợp, E. coli phát triển rất nhanh, thời gian để
sản sinh ra một thế hệ mới chỉ mất khoảng 20 phút. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng
(canh thang), sau 3 đến 4 giờ E. coli có khả năng làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ
làm đục đều môi trường và sau 2 ngày tạo thành một váng mỏng trên bề mặt môi
trường. Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dùng kính lúp có thể
quan sát được những khuẩn lạc li ti. Sau 24 giờ, kích thước khuẩn lạc thường
khoảng 1,5 mm.
E. coli không phát triển trong môi trường Salmonella-Shigella (SS), Kauffmann
và môi trường Wilson Blair (Đoàn Thị Ngọc Tuyền, 2005).
2.2.1.4

Kháng nguyên

Từ năm 1930, Kauffmann đã đưa ra biểu đồ phân loại type huyết thanh của
E. coli dựa trên kháng nguyên thân (O), kháng nguyên vỏ (K), kháng nguyên lông (H).
●


làm hơn 3.800 người nhiễm bệnh và cướp đi sinh mạng của hơn 54 người, nhiều nạn
nhân may mắn thoát chết cũng rơi vào tình trạng suy thận nghiêm trọng. Theo bản báo
cáo của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh châu Âu, dịch bệnh đang có
chiều hướng lây lan sang các quốc gia lân cận. Tại Thụy Điển, các nhà chức trách địa
phương đã phát hiện ra 9 trường hợp mắc phải hội chứng HUS (hội chứng tán huyết –
tăng urê máu do nhiễm phải chủng E. coli O157:H7), trong đó có 4 người vừa đến
miền bắc nước Đức. Đan Mạch có 4 người nhiễm, Anh có 3 người nhễm và Hà Lan có
1 người bị nhiễm phải hội chứng HUS (ECDC, 2011).
Một cuộc khảo sát ở Việt Nam cho thấy, trong tổng số 90 mẫu thịt kiểm tra có
đến hơn 50% số mẫu bị nhiễm E. coli. Toàn bộ 100% chủng phân lập được có độc lực
cao, đều gây chết chuột bạch trong phòng thí nghiệm trong vòng 24-72 giờ. Trong số
các chủng E. coli phân lập được, có 3 chủng thuộc về serotype O26, O55, O157 có thể
gây nguy hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng (Trần Thị Hương Giang và Huỳnh Thị
Mỹ Lệ, 2012).

6


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

2.2.2

Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

2.2.2.1

Hệ thống phân loại khoa học
Giới

2.2.2.2

Đặc điểm hình thái

P. aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, có lông duy nhất ở một đầu, thường dài
1,5-3 µm và rộng 0,5-1 µm. Hầu hết các chủng P. aeruginosa đều có vỏ và khả năng
di động (Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2007).
2.2.2.3

Tính chất nuôi cấy

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Thu Trang (2007), P. aeruginosa là
vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-42ºC nhưng thích hợp nhất
là 37ºC ở mức pH trung tính, dễ dàng phát triển trong các môi trường thông thường.
Khi được nuôi cấy trên môi trường thạch máu khoảng sau 8 đến 10 giờ, có thể
quan sát thấy những khuẩn lạc li ti dưới kính lúp. Hình thái khuẩn lạc điển hình là dạng
S (Smooth), nhưng cũng có thể gặp dạng R (Rough) hoặc M (Mucoid), trong đó khuẩn
lạc dạng M và dạng S có khả năng gây bệnh mạnh nhất (Nguyễn Thị Hải, 2010).
●

Khuẩn lạc dạng S: đường kính 1-2 mm, tròn, trơn và hơi lồi sau 18-24 giờ,

có thể tan máu beta, có ánh kim, có sắc tố xanh lục, có thêm mùi thơm đặc biệt
như mùi nho.
7


Luận văn tốt nghiệp Đại học
●


pyorubrin.
●

Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ có 1 đến 2% số chủng P. aeruginosa

sinh sắc tố pyomelanin.
Có khoảng 5 đến 10% số chủng P. aeruginosa không sinh sắc tố.
2.2.2.4

Kháng nguyên

P. aeruginosa có 2 loại kháng nguyên: H và O (Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2010).
●

Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của vi khuẩn. Kháng nguyên

thường không chịu được nhiệt, bị cồn 50º và các men tiêu protein phá hủy, chịu
được tác động của formol 0,5%.
●

Kháng nguyên O: là kháng nguyên thân, đã có đến 16 loại do đó dựa vào

kháng nguyên O để phân chia P. aeruginosa thành 16 type huyết thanh ký hiệu từ
8


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

2.2.3

Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.2.3.1

Hệ thống phân loại khoa học
Lãnh giới Bacteria

2.2.3.2

Giới

Eubacteria

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli

Bộ

Bacillales

lạc lồi, bóng láng, óng ánh, đường kính 1-2 mm, có thể có màu vàng đậm, vàng cam
hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát
triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố
(hemolysine) là: α, β, γ, δ và ε.

10


Luận văn tốt nghiệp Đại học
2.2.3.4

Sinh học k37

Kháng nguyên

S. aureus có chứa nhiều loại kháng nguyên như: protein, polysaccharide, acid
teichoic của vách tế bào vi khuẩn (Nguyễn Trần Hải Hoàng, 2014).
●

Acid teichoic: là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu làm tăng tác

dụng hoạt hóa bổ thể. Acid teichoic là một thành phần của kháng nguyên O có tác dụng
như một chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này thường gắn vào
polysaccharide của tụ cầu vàng.
●

Protein A: là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một

tiêu chuẩn để xác định tụ cầu vàng. 100% chủng tụ cầu vàng có protein này.
●

O., 2002).
Tại Mỹ, từ năm 1969-1990 có đến 50% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký
sinh trong thịt gây ra (đặc biệt là thịt muối), 22% số vụ ngộ độc thực phẩm do
S. aureus ký sinh trong gia cầm, 8% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký sinh
trong sữa và sản phẩm từ sữa, 7% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký sinh trong
cá, tôm, cua hoặc ghẹ và 3,5% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký sinh trong
trứng (Wieneke and et al., 1993).
2.2.4

Vi khuẩn V. parahaemolyticus

2.2.4.1

Hệ thống phân loại khoa học
Giới

Bacteria

Ngành

Proteobacteria

Lớp

Gamma Proteobacteria

Bộ

Vibrionales



V. parahaemolyticus là vi khuẩn rất khó phát triển trên các loại thạch thông
thường. Vi khuẩn có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 15ºC-65ºC, nhưng thuận lợi nhất
là ở 37ºC. pH thích hợp ở mức 7,8-8,6.
V. parahaemolyticus khi được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, có khả năng
làm đục môi trường rất nhanh.
Thiosulfate-Citrate Bile Salts (TCBS) là môi trường phát triển đặc trưng cho
vi khuẩn V. parahaemolyticus. Khuẩn lạc thường không màu (dễ bắt màu của môi
trường nuôi cấy), tâm thường bắt màu xanh lá cây đậm hơn so với màu của môi trường,
đường kính thường giao động từ 3-4 mm. Phản ứng tán huyết rất rõ trong môi trường
thạch máu.
2.2.4.4

Kháng nguyên

V. parahaemolyticus có 3 loại kháng nguyên là: O, H và K.
●

Kháng nguyên thân O: chịu nhiệt, được chia thành 12 type.

●

Kháng nguyên lông H.

●

Kháng nguyên vỏ K: không chịu nhiệt, được chia thành 59 type.

2.2.4.5