ghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của
Wedelolaction từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm
trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể
Dectin - 1 : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 30 / Thân
Văn Minh ; ghd. : TS. Trịnh Tất Cường
Nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng là hội chứng lâm sàng đặc trưng bởi
viêm hệ thống do nhiễm trùng. Ngay cả điều trị tối ưu, tỉ lệ tử vong do nhiễm
trùng nặng và choáng nhiễm trùng gần 40%. Tần suất của nhiễm trùng nặng và
choáng nhiễm trùng gia tăng 15 năm gần đây. Tại Mỹ: 750.000 ca/năm; là 1 trong
10 nguyên nhân tử vong thường gặp. Mặc dù, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm
trùng đã được phát hiện từ 30 năm trước, nhưng các bệnh nhân mắc căn bệnh này
vẫn có khả năng tử vong rất cao. Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp và tá dược
chữa bệnh là một vấn đề cần thiết và cấp bách để điều trị hiệu quả quá trình viêm
hệ thống, và sẽ hỗ trợ cải thiện được khả năng điều trị của bệnh nhân bị nhiễm
trùng nặng và choáng nhiễm trùng.
Cây nhọ nồi (có tên khoa học là Eclipta prostrata hoặc Eclipta alba) là thực
vật thuộc họ cúc (Asteraceae) và mọc ở những vùng Nm như một loại cỏ ở khắp
thế giới. Cây nhọ nồi mọc nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt N am [2] .
Các hoạt tính dược học của Wedelolactone từ nhọ nồi đã được chứng minh ở in
vitro và in vivo [31].
Cho đến nay, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng vẫn là một trong các
nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt
(ICU). Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp trên thế giới. Tại Việt
N am, trong nghiên cứu chiết xuất tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của
Wedelolactone từ cây nhọ nồi Việt N am đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm


Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà
N ội. Bước đầu đã cho thấy tác dụng của chất này trong quá trình chống viêm.
Với hoạt tính phòng chống viêm đầy tiêm năng của Wedelolactone, chúng tôi
muốn nghiên cứu sâu hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm và khả năng điều



chemokine tiền viêm, và thậm trí là kích thích quá trình ban đầu của miễn dịch đáp
ứng.
2. KHÁI IỆM VIÊM
Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao
mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh
hay là những tế bào bị hỏng. Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay
sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi. Khi phản ứng viêm xảy ra,
nhiều loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm như các loại tế bào di
chuyển (migrating cells) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa nhân, các tế bào lympho,
tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào này giải phóng ra hàng loạt các chất trung
gian, phần lớn là các chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine,
bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu và interleukin-1. Các chất này lại tiếp tục
hoạt hóa các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ
yếu phân giải protein như các proteinase, các interleukin, yếu tố ngoại tử khối u
(TN F-α), các superoxide, H+, hydroperoxide gây ra tổn thương mô, qua đó khép
kín quá trình viêm mạn tính. Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm
tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ,
nóng. Một vài chất tiết ra làm hẹp dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng. Khi quá
trình viêm kéo dài sẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do quá
trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu
thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục
bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do
viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [23].
3. HIỄM TRÙ G Ặ G VÀ CHOÁ G HIỄM TRÙ G
N hiễm trùng có thể được định nghĩa như một phổ của những điều kiện lâm
sàng gây ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân tới quá trình nhiễm trùng mà
được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [6,7,8]. Các bệnh nhân mắc


hai, các tế bào và các phân tử kiểm soát hoặc phá hủy các mầm bệnh mà có thể
trốn thoát khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên trong. Thứ


ba cũng là hàng rào quan trọng nhất của hệ thống bảo vệ miễn dịch bNm sinh đó
các mô của tế bào macrophage truyền tin hiệu bảo vệ tế bào ở các vùng ngoại biên
và hệ thống bổ thể của protein truyền tín hiệu của hệ thống miễn dịch bNm sinh
dưới dạng dịch nằm giữa khoảng không của mô và máu. Quá trình nhận dạng bằng
hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ các mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số cơ chế
hiệu quả khác nhau. Hệ thống miễn dịch bNm sinh có thể xem như có vai trò quan
trọng nhất trong quá trình viêm nhiễm.
4.1. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs)
Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) được
chia làm ba nhóm chính bắt nguồn từ vị trí trong tế bào đó là: thụ thể huyết thanh
hoặc phần dịch của mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm trên màng hoặc
trong dịch tế bào được xem là thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19]. Mỗi nhóm thụ
thể PRR có các phối tử đặc hiệu của chính mình để có thể nhận dạng một loại vi
sinh vật nhất định [19]. Các thụ thể này có thể nhận dạng mầm bệnh một cách trực
tiếp (không thông qua opsonin) hoặc gián tiếp (thông qua oposonin) [19]. Đối với
In vivo, nhiều thụ thể có thể tham gia để nhận dạng vi khuNn thông qua đa phản
ứng ở đa vị trí. Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn được nhận bằng PRR
giống như thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể 3 (CR3), và dectin-1 [20]. Quá
trình nhận dạng mầm bệnh của PRR kích thích quá trình sản xuất cytokine và
chemokine dẫn tới quá trình hoạt động và sinh ra các tế bào khác tham gia tới vị trí
đang trong quá trình bị viêm nhiễm. Từ đây, dẫn tới những phản ứng của miễn
dịch đáp ứng [12].
Fungi

Fungi


interferon-β (TRIF), và phân tử tiếp nối với TRIF (TRAM) [20]. Quá trình nhận
dạng mầm bệnh của TLR2 sẽ kích thích quá trình hoạt động của yếu tố hoạt động
nhân tế bào là N F-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells), và sản xuất ra các cytokine tiền viêm như tumor necrosis factor, TN F-α thông
qua đoạn TIRAP và đoạn MyD88, nhưng quá trình nhận dạng của TLR4 lại kích
thích hoạt động của N F-κB thông qua TIRAP, MyD88 và kích thích hoạt động của
đoạn phiễn mã của interferon (IFN ) giống như quá trình sản xuất IFN kiểu 1 [27].


4.3.Thụ thể Dectin- 1
Quá trình nhiễm nấm đã kích hoạt quá trình hoạt động ban đầu của các đáp
ứng miễn dịch bNm sinh trong động vật có vú thông qua các cơ quan cảm ứng đối
với quá trình nhiễm trùng [16]. Chất β-glucan là một thành phần quan trọng trong
vỏ của tế bào của nấm. Tế bào có thể nhận ra được thành phần này khi xâm nhập
đó là nhờ vao sự hoạt động của thụ thể Dectin-1. Thụ thể này nằm trên màng tế
bào có một đoạn kiểu C lectin gắn với loại màng kiểu II và có một đoạn bên trong
cytoplasma của tế bào cùng với một phần hoạt động dựa vào thụ thể miễn dịch
tyrosine [8].
Dectin-1 được biểu hiện trên các dòng tế bào myeloid, monocyte, đại thực
bào, tế bào trung tính và tế bào tua [16]. Cho đến nay thụ thể Dectin-1 đã được
hiểu rất rõ là một thụ thể biểu hiện mạnh nhất trên đại thực bào trong quá trình
thực bào của nấm. Đặc biệt thụ thể này có thể nhận dạng đặc hiệu đối với β-glucan
hoặc zymosan (một chất có chứa một hàm lượng lớn β-glucan và được tách chiết
từ Sacchomyces). Các đáp ứng thực bào đối với quá trình nhận dạng vi sinh vật sẽ
sản xuất ra các cytokine, chemokine, quá trình thực bào hóa, giết mầm bệnh bằng
sản xuất ra các peptide kháng vi sinh vật, phản ứng oxy hóa (ROS) và RN S [16].
4.4. Thụ thể Dectin-1 hoạt động cùng với TLR2 để nhận dạng các phối tử có
nguồn gốc từ vi sinh vật
Zymosan là một hợp chất mà lượng β-glucan trong thành tế bào của
Saccharomyces cerevisiae chiếm phần chính [8,16]. Thành phần của zymosan có


4.5. Glucocorticoid
Glucocorticoid đã được sử dụng như một chất chống viêm cùng với rất
nhiều cơ chế trong quá trình hoạt động của nó [17]. Rất nhiều nghiên cứu đã
chứng minh glucocorticoid có thể điều hòa được chức năng của các tế bào viêm,
đặc biệt là quá trình phiên mã của các gen sinh cytokine [11]. Hơn nữa,
glucocorticoid có thể ức chế quá trình sản xuất các cytokine tiền viêm như TN F-α,
IL-6, IL-1, và làm giảm quá trình tiết gốc nito và quá trình hoạt hóa các yếu tố mô
trong tế bào macrophage [22]. Do vậy, glucocorticoid đã được sử dụng trong điều
trị một số bệnh viêm nhiễm và các bệnh mẫn cảm miễn dịch. N hưng hơn nữa,
chúng có tiềm năng vô cùng to lớn trong hoạt động kháng viêm và giảm quá trình
miễn dịch không có lợi cho cơ thể [9,17, 21].
N hìn chung, quá trình viêm hệ thống mất kiểm soát được xem như là các
đặc trưng của nhiễm trùng, của triệu chứng viêm cấp tính đường hô hấp. Một chất
được biết đó Hydrocortisone, là một glucocorticoid, có thể làm giảm đi đáng kể
mức plasma của protein C, phospholipase A2, và loại bỏ bớt các tế bào neutrophil
trong các bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [22]. N hững
nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra chất này có thể điều hòa hầu hết các cytokine tiền
viêm [11], bao gồm ức chế các cytokine có vai trò quan trọng trong miễn dịch bNm
sinh và nhiễm trùng [22]. Hiệu quả của glucocorticoid đã được chứng minh trong
các bệnh nhiễm trùng nặng như nhiễm vi khuNn meningitis, pneumocystis
pneumonia, typhoid fever, và những trường hợp nhiễm H5N 1 [11].
4.6 ROS và p47phox
4.6.1.Gốc oxy hóa ROS


ROS (reactive oxygen species) là một đại diện nhỏ của phản ứng oxy hóa,
bao gồm superoxide (O2-) anion, hydrogen peroxide (H2O2), peroxyl (ROO-)
radical, acid (HOCl), ozone (O3)[14]. ROS được tạo ra thông qua một loạt các
phản ứng mà bắt đầu bằng quá trình tạo ra superoxide [14]. Quá trình tạo ra ROS

hoạt động, có sự thay đổi của GDP đối với guanosine-5'-triphosphate (GTP) trên Ras
được xem như là độc tố C3 botulinum dẫn tới kích hoạt. Lúc này, p47phox được phospho
hóa và truyền tín hiệu tới và làm cho phức hệ p67phox, p40phox được chuyển tới trên
màng tế bào plasma. Quá trình phospho hóa của p47phox sẽ làm thay đổi cấu trúc dẫn
tới tương tác với p22phox. Quá trình chuyển tới màng của phức hệ p67phox, p40phox sẽ
làm cho p67phox tương tác với ox2. Cuối cùng enzym GTP trên Rac tương tác cùng với
ox2. Phức hệ được hoạt động và tạo ra superoxide (O2-) bằng chuyển electron từ
ADPH trong cytoplasma thành oxy hóa ra ngoài tế bào [14].

4.7. Vai trò của đại thực bào trong đáp ứng viêm
Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào,
có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch
đặc hiệu ở động vật có xương sống. Vai trò chính của chúng là thực bào các thành
phần cặn bã của tế bào và các tác nhân gây bệnh. N goài ra, chúng còn đóng vai trò
các tế bào trình diện kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ
thể. Do đóng vai trò quan trọng trong quá trình thực bào của cơ thể, đại thực bào


có liên quan đến một số tình trạng bệnh lý do miễn dịch. Ví dụ các đại thực bào
tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do
nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong
nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm mạnh, đóng vai
trò quan trọng trong quá trình bệnh lý của các hội chứng này. Các cytokine chính
được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố họai tử khối u
TN F-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN -γ, nitric oxide (N O) vàc các phân tử dính kết tế bào
dẫn đến làm tăng quá trình viêm. N hư vậy, việc kiểm soát sản xuất các chất này có
thể làm giảm khả năng viêm. Macrophage là tế bào có kích thước tương đối lớn và
có khả năng đáp ứng nhanh với các kích thích viêm tạo ra bởi LPS. N goài ra, các
TLR ở macrophage được biểu hiện mạnh hơn so với các tế bào bạch cầu khác
(Hình 4) nên nó thường được lựa chọn trong các mô hình sàng lọc và nghiên cứu

gây viêm sẽ được tiêm chất nghiên cứu. Hàm lượng các chất trung gian tiết ra
trong quá trình tiền viêm cũng như những yếu tố tham giá vào các con đường tín
hiệu viêm được theo dõi và đánh giá, ví dụ như cytokine, chemokine tiền viêm
(T F-a; IL-6, IL-8) và kháng viêm(IL-10), interferon, quá trình phospho hóa các
yếu tố tự phân bào protein kinase (MAPKs), hay phản ứng ôxy hóa. Từ đó tác
dụng của chất nghiên cứu được khẳng định. Với mô hình in vivo này, việc đánh
giá tác dụng của chất kháng viêm sẽ có hệ thống, chính xác và chi tiết hơn ở mức
phân tử .
6. TÌ H HÌ H GHIÊ CỨU TRO G VÀ GOÀI ƯỚC
6.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính gồm:
6.1.1. Các chất kháng viêm không có bản chất steroid ( SAID)


Đại diện cho nhóm này là aspirin, ibuprofen và naproxen. Cơ chế kháng viêm
của N SAID được phát hiện là do chúng ức chế sự tổng hợp PG. Đích tác dụng
được biết rõ nhất của các chất này là cyclooxygenase (COX), là enzym có vai trò
chuyển hóa axit arachidonic thành prostaglandins (PG) và thromboxane (TX). Một
số N SAID lại có khả năng ức chế enzym liên quan đến sự bào mòn màng nhày dạ
dày. N ghiên cứu lâm sàng đã chứng minh các chất N SAID này có tác dụng ức chế
sự hình thành PG ở màng nhày dạ dày. Tuy nhiên, salysilate, một chất kháng
viêm thuộc nhóm này cũng có tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp của PG nhưng lại
không làm bào mòn màng nhày dạ dày như aspirin. Lý do tại sao lại có sự khác
nhau về cơ chế tác dụng giữa aspirin và salisylate là vấn đề chưa giải thích được
[31].
6.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid
Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vòng 4 cycloalkane.
Thuộc về nhóm chất này có các chất corticoid. Chúng tác dụng thông qua ức chế
enzyme phospholipases A2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa
phospholipase A2 thành axit arachidonic. N hư vậy, cuối cùng thì corticoid cũng

nguồn dược liệu Việt N am có thể sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc để tìm ra
những chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất chống viêm mới
có hiệu quả cao mà không gây ra các phản ứng phụ. Tuy vậy, có thể nói các
nghiên cứu khoa học một cách có hệ thống và chi tiết về điều tra, khai thác, đánh
giá tác dụng và sử dụng các chất hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên sinh vật
trong nước để phát triển thành các sản phNm thuốc mới, phục vụ cho bảo vệ và
chăm sóc sức khỏe cộng đồng còn rất hạn chế.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng viêm, có thể nói rằng
chúng ta chưa có các nghiên cứu sâu cũng như chưa có các hệ thống và mô hình
nghiên cứu hiện đại về quá trình viêm và tác dụng của chất chống viêm. Đây chính
là cơ sở để phát triển các sản phNm thuốc có thể thương mại được trên thị trường
Việt N am và quốc tế. Các nghiên cứu về viêm được thực hiện chủ yếu ở Viện


Dược liệu Trung ương, các trường Đại học Dược, trường Đại học Y Hà N ội và
Học viện Quân y 103. Các nghiên cứu ở những cơ sở này mới chỉ dừng ở mức tạo
được mô hình gây viêm thực nghiệm in vivo cổ điển như đã trình bày ở trên. Cụ
thể là các thí nghiệm được thực hiện trên chuột thông qua sử dụng chất gây viêm
carrageenan để tạo mô hình viêm cấp dưới hình thức gây phù bàn chân chuột và
gây viêm màng bụng chuột sau khi tiêm chất gây viêm này. Việc gây viêm mãn
tính sử dụng chất amiant để tạo u hạt trong cơ thể chuột. Việc đánh giá tác dụng
kháng viêm được thực hiện bằng cách đo thể tích bàn chân, đo thể tích dịch viêm ổ
bụng, đo trọng lượng khối u hạt tách ra, đếm số lượng bạch cầu so với mẫu đối
chứng, từ đó đánh giá tác dụng kháng viêm của các chất nghiên cứu. N goài ra,
việc đánh giá tác dụng kháng viêm cũng chủ yếu được thực hiện với các cao chiết
thô của thực vật. Điển hình như các nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng và cộng sự
với các dịch chiết rong tảo biển Việt N am[1]. N hóm nghiên cứu đã phát hiện thấy
dịch chiết methanol của hai loài tảo biển là Sargassum swartzii và Ulva reticulata
thể hiện hoạt tính kháng viêm cao mà không gây độc với động vật thử nghiệm [1].
Hàng loạt các nghiên cứu khác trong thời gian gần đây cũng chỉ sử dụng các mô

alba Hassk, hoặc Eclipta prostrata L.) là một loài cây thuộc Họ Cúc.
Cây nhọ nồi là cây cỏ, sống một hay nhiều năm, mọc đứng hay mọc bò, cao 3040cm. Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lông cứng. Lá mọc
đối, gần như không cuống, mép khía răng rất nhỏ; hai mặt lá có lông. Hoa hình
đầu, màu trắng, mọc ở kẽ lá hoặc ngọn thân, gồm hoa cái ở ngoài và hoa lưỡng
tính ở giữa. Quả bế dài 3mm, có 2-3 vảy nhỏ, có 3 cạnh, hơi dẹt.


Hình 5: Cây nhọ nồi

Theo đông y cây nhọ nồi có thể chữa can, thận âm hư, các chứng huyết
nhiệt, chứng ho ra máu, nôn ra máu, đại tiện và tiểu tiện ra máu, chảy máu cam,
chảy máu dưới da, băng huyết rong huyết, râu tóc sớm bạc, răng lợi sưng đau.
7.2. Wedelolactone
Cây nhọ nồi bao gồm nhiều hợp chất hữu cơ giống như wedelolactone (I) và
demethylwedelolactone (II), polypeptide, polyacetylene, dẫn suất thiophene,
steroid, triterpene and flavonoid [30]. Đặc biệt, Wedelolactone được biết có một
loạt những hoạt tính sinh học và được sử dụng trong điều trị bệnh viêm gan, xơ
gan, kháng vi khuNn [30]. N goài ra, Kobori và cộng sự đã chứng minh được vai trò
của Wedelolactone như một chất ức chế IKK, một kinase đóng vai trò quan trọng
trong hoạt động của yếu tố N F-κB, bằng cách tác động đến con đường photphoryl
hóa IκBα [30].
Bên cạnh đó, một hợp chất hữu cơ tự nhiên bao gồm Wedelolactone và một số
chất từ cây Wedelia canlendulacea đã được sử dụng trong y học ở N am Mỹ giống
như thuốc kháng lại nọc độc của rắn [32]. Trong y học truyền thống của Trung
Quốc, Wedelolactone được sử dụng điều trị những bệnh về gan, các bệnh viêm
nhiễm virut [30]. Hơn nữa, Wedelolactone có khả năng giảm sự phát triển của ung
thư. Gần đây, một số nghiên cứu đã công bố Wedelolactone có khả năng ức chế sự
phát triển của dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến, tuyến yên, và hiệu quả trên dòng
tế bào MDA-MB-23 (tế bào ung thư vú) [30]. N goài ra, mới đây, hoạt tính của
Wedelolactone tách chiết từ cây nhọ nồi đã được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm



2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột
2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng sống của
BMDM bằng kít đếm tế bào sống chết
2.2.3. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit
2.2.4. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản ứng oxy
hóa
2.2.5. Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm
zymosan
2.2.6. Đánh giá hiệu quả sống xót của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng
nhiễm trùng trong chuột bằng Wedelolactone
2.2.7. Đánh giá hiệu quả ức chế quá trình sinh cytokine trong huyết thanh của
Chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng tiêm Wedelolactone
2.2.8. Đánh giá hiệu quả Wedelolactone và Dexamethason trong điều trị chuột
bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng
2.2.9.Phân tích thống kê

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ
1. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hưởng bởi Wedelolactone
Để khẳng định Wedelolactone có gây độc tố đối với tế bào BMDM hay
không, BMDM được chia đều vào các giếng khác nhau trên đĩa nuôi tế bào 96
giếng với mật độ 1x 105. Các BMDM này được sử lý với Wedelolactone ở các
nồng độ khác nhau như trên hình 1. Sau đó, BMDM được ủ cùng với 10 µl kit đếm
tế bào. Kết quả được chỉ ra ở trên Hình 1, tỉ lệ phần trăm của các BMDMs không
có sự khác biệt giữa BMDMs được sử lý với các nồng độ khác nhau của
Wedelolactone sau 48 giờ. Kết quả này, cho thấy Wedelolactone không có khả
năng gây độc với BMDM.



IL 12p40, IL-10 tăng dần từ mốc 0h , 4h ,8h , 18h sau đó bắt đầu giảm. Từ kết quả
này, chỉ ra rằng thời gian ủ Zymosan để sinh ra Cytokine nhiều nhất là sau 18 giờ


nồng độ cytokine (pg/ml)
15000

nồng độ cytokine (pg/ml)
15000 IL-6

TNF-α

10000

10000

5000

5000

0

12000

0 4 8

18

48


48 (h)

0

0 4 8

18

48 (h)

Hình 9: Zymosan kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và
kháng viêm.
BMDMs từ chuột được ủ với zymosan 100 (µg/ml). Dịch tế bào được ủ với
zymosan ở các thời gian khác nhau lần lượt là 0, 4, 8, 18, 48 giờ sẽ được đánh giá đối
với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA.. Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa
bởi 5 thí nghiệm độc lập.

3. Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM được
kích thích bởi zymosan
Wedelolactone có khả năng làm giảm sốt, chống ung thư (). Tuy nhiên, vai
trò của nó trong quá trình truyền tín hiệu viêm gây ra bởi zymosan vẫn chưa được
chứng minh. Để đánh giá hiệu quả Wedelolactone trong quá trình này, BMDM đã
được ủ với các nồng độ khác nhau của Wedelolactone trong 45 phút. Sau đó,
BMDM được ủ tiếp với zymosan sau 18 giờ. Từ hình 10 cho thấy Wedelolactone


đã ức chế quá trình sản xuất cytokine tiền viêm TN F, IL-6, IL12p40. Trái lại, đối
với protein kháng viêm IL-10 thì Wedelolactone lại không có khả năng ức chế. Từ
kết quả này cho thấy với nồng độ
nồng độ cytokine (pg/ml)


2.5

5

BMDM
được kích thích bằng zymosan
W

10

20 µg/ml

W
zymosan

zymosan

4. Wedelolactone điều hòa quá trình sinh12000
cytokine
tiền viêm thông qua thụ
IL-10
12000 IL-12p40

thể Dectin-1
8000
Thụ

8000


10 đã được
20 µg/ml
W

zymosan

zymosan
laminarin, một chất có
khả năng ức chế quá trình hoạt động của thụ thể Dectin-1

[27], hoặc polysaccharide galactan ở các nồng độ giống như laminarin sau 45 phút.
Tiếp theo, các tế bàozymosan
được ủ cùng với Wedelolactone (hình 11A), Dex (hình 11B)
trước khi ủ với zymosan. Tế bào ủ cùng với Laminarin xuất hiện quá trình sinh ra
cytokine ngược lại với tế bào không sử lý với Laminarin ở hình 11A. Các cytokine
TN F-α, and IL-6 in BMDMs đã tăng dần theo nồng độ của Laminarin. Trái lại, các
tế bào được sử lý cùng với polysaccharide galactan vẫn cho kết quả giống như tế
bào được sử lý với Wedelolactone. Giống như kết quả Hinh 11A, các kết quả trên
hình 4B cũng cho kết quả tương tự. N hững kết quả này gợi ý rằng thụ thể Dectin-1
có một vai trò cơ bản trong quá trình Wedelolactone và Dex truyền đi quá trình ức
chế zymosan kích thích sinh ra cytokine tiền viêm trong BMDMs.

A

B

4800

4800


bằng zymosan thông qua thụ thể dectin-1.
5. Wedelolactone điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thông
qua thụ thể Dectin-1
Zymosan có thể kích thích quá trình sản xuất ROS trong đại thực bào [16].
Tuy nhiên, vai trò của Wedelolactone trong quá trình sinh ROS do zymonsan kích
thích trong BMDB vẫn chưa rõ. Để điều tra quá trình này, BMDMs đã được ủ
cùng với Laminarin hoặc Galactan trong 60 phút trước khi ủ với Wedelolactone
(20g/ml) hoặc Dex (100nM). Sau đó, các tế bào này được ủ tiếp với zymosan
trong 30 phút. Các tế bào này tiếp tục được ủ với DHE theo như phần phương
pháp. N hư chỉ ra ở Hình 12A, zymosan đã kích thích tạo ra ROS, tuy nhiên quá
trình sản xuất ROS đã bị ức chế bởi tế bào được ủ với Wedelolactone nhưng quá
trình này bị đảo ngược đối với tế bào được ủ với Laminarin. Tuy nhiên, điều này
không xảy ra với tế bào được ủ với galactan. Trên hình 12B, kết quả tương tự hình
12A khi thay Wedelolactone bằng Dex. N hững kết quả này chỉ ra rằng
Wedelolactone đã điều hòa quá trình sinh ROS do zymosan kích thích trong
BMDM thông qua thụ thể Dectin-1.