I.

MỞ ĐẦU

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà
khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ
biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh
trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế
biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và
bảo vệ môi trường.
Ngày nay, bia là loại đồ uống không thể thiếu đối với cuộc sống của con
người. Bia là loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc
cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ enzyme phong
phú, kích thích tiêu hoá cho cơ thể con người.
Hiện nay, trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzyme
amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có trong mầm đại mạch.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng các enzyme khác có trong mầm đại mạch để
thủy phân và chuyển hóa các chất không tan sang trạng thái tan như chuyển
protein, cellulose… sang amino acid và glucose. Lợi dụng quy luật sinh lý bình
thường này của hạt, loài người đã biết can thiệp rất khoa học để quá trình trên
được tiến hành nhanh hơn, mạnh hơn và biết ngưng ở giai đoạn nhất định, phục
vụ cho mục đích của mình trong việc tạo ra sản phẩm là bia chứ không phải là
cây lúa mạch như trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên, xét về mặt kỹ thuật
thấy có một số thiếu sót cơ bản như lượng chất khô bị tiêu hao trong quá trình
nảy mầm là rất lớn; quá trình này đòi hỏi thời gian cho sinh tổng hợp các loại
enzyme và quá trình chuyển hóa vật chất ; … do đó , sử dụng enzyme từ vi sinh
vật là hướng nghiên cứu và ứng dụng ở nhiều nước. Việc ứng dụng enzyme từ
nguồn vi sinh vật vào sản xuất bia không phải là nhằm mục đích thay thế hoàn
toàn amylase có trong hạt malt mà chỉ ứng dụng vào từng công đoạn nhất định
để hoàn thiện hơn trong quá trình sản xuất. Tuy nhiên, các nhà máy bia ở nước

có mức tiêu thụ bia trên đầu người thấp thì đến nay tăng bình quân 6,5%/ năm.
Thái Lan có mức tăng bình quân cao nhất 26,5%/ năm, tiếp theo là philippin
22,2%/ năm, Malaysia 21,7%/ năm, Indonexia 17,7%/ năm. Đấy là những nước
có tốc độ tăng nhanh trong khu vực.
Thị trường bia Nhật Bản chiếm 66% thị trường bia khu vực với 30,9 tỉ
USD. Năm 1939 sản lượng bia ở Nhật Bản là 30 triệu lít và mức tiêu thụ đầu
người tương đương ở Việt Nam hiện nay, năm 1960 sản lượng bia vượt quá 100
triệu lít, đến năm 1991 mức tiêu thụ bình quân đầu người là 55,6 lít/ người/ năm.
Lượng bia tiêu thụ trong năm 2004 đã đạt trên 6500 triệu lít.
Công nghiệp bia của Trung Quốc phát triển là nguyên nhân chủ yếu thúc
đẩy sự tăng trưởng của ngành bia châu Á. Từ năm 1980-1990 sản lượng bia tăng
từ 69,8 triệu lít lên 1230 triệu lít, tức tăng 17 lần. Thời kỳ từ 1981-1987 mức
tăng trưởng trên 20%. Đến năm 2004, tổng lượng bia tiêu thụ ở Trung Quốc là
28640 triệu lít, xếp thứ hạng đầu tiên trên thế giới.
Tổng lượng bia tiêu thụ của các nước khu vực châu Á trong năm 2004 đạt
43147 triệu lít, tăng 11,2% so với năm 2003.
II.1.2. Tại Việt Nam

3


Bia được đưa vào Việt Nam từ năm 1890 cùng với sự có mặt của nhà máy
bia Sài Gòn và nhà máy bia Hà Nội, như vậy ngành bia Việt Nam có lịch sử trên
100 năm.
Hiện nay nhu cầu của thị trường, chỉ trong một thời gian ngắn, ngành sản
xuất bia có những bước phát triển mạnh mẽ thông qua việc đầu tư và mở rộng
các nhà máy bia đã có từ trước và xây dựng các nhà máy bia mới thuộc Trung
ương và địa phương quản lý, các nhà máy lien doanh với các hãng nước ngoài.
Công nghiệp bia phát triển kéo theo sự phát triển của các ngành sản xuất khác.
Ngành bia là một trong những ngành có mức thuế TTĐB cao lên hàng

công tại một số địa phương nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người
tiêu dùng
+ Về thương hiệu bia
Những thương hiệu bia sản xuất tại việt nam đang chiếm ưu thế, đứng vứng trên
thị trường và có khả năng tiếp tục phát triển mạnh trong quá trình hội nhập, đó
là: Sài Gòn, Sài Gòn special, 333, Hà Nội, Heineken, Tiger, Halida… Lượng bia
thuộc các thương hiệu này đạt 713,8 triệu lít chiếm 55,24% thị phần tiêu thụ.
Mảng thị trường bia cao cấp cũng đã xuất hiện một số loại bia nhập khẩu và các
nhà máy bia tươi ( tại Hà Nội, cũng như thành phố Hồ Chí Minh có trên 10 nhà
hàng bia tươi) với sản lượng nhỏ nhưng đang ngày càng được ưa chuộng.

+ Về trình độ công nghệ và thiết bị:
Các nhà máy bia có công suất trên 100 triệu lít/ năm đều có hệ thống thiết
bị hiện đại, tieentieens nhập khẩu từ các nước có nền công nghiệp sản xuất bia
5


phát triển như: Đức, Đan Mạch… Các nhà máy bia có công suất trên 20 triệu lít/
năm cho đến nay đã đầu tư chiều sâu, đổi mới thiết bị, tiếp thu trình độ công
nghệ tiên tiến vào sản xuất
+ Về nguyên liệu cho ngành bia
Năm 2003, kim ngạch nhập khẩu nguyên liệu cho ngành sản xuất bia
( chủ yếu là malt và hoa houblon) khoảng 76 triệu Usd. Tổng công ty Habeco đã
thử thử nghiệm trồng cây đại mạch ở một số nơi nhưng chưa có kết quả do sự
không phù hợp về thổ nhưỡng và khí hậu. hiện tại, đã có một nhà máy sản xuất
malt đại mạch với công suất trên 50000 tấn/ năm và có khả năng mở rộng nên
100000 tấn/ năm

6


II.2.1. Enzyme - amylase
a) Cấu tạo:
Enzyme α-Amylase là proteincó phân tử lượng thấp, thường nằm trong
khoảng50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ
loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay
người ta đã biết rất rõ cácchuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2
loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn
được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấutrúc bậc 3. Mới đây các nghiên
cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kịnước cho thấy các
chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3
tương tự nhau

Cấu trúc không gian của α-Amylase
b. Cơ chế tác dụng:
α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. αAmylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong
phân tử cơ chất ( tinh bộthoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một
trật tự nào cả. α-Amylase không chỉthủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả
hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm.
8


Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn:
+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị
thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của
hồ tinh bột giảm nhanh( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ).
+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine.
Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và
monosaccharide. Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh
thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vìvậy, người ta cho rằng αAmylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốcglucopiranose 1 ).

d. Phương pháp thu nhận.
* Phương pháp thu từ malt đại mạch.
* Phương pháp thu nhận từ Vi sinh vật:
- Sự tổng hợp enzyme amylase không những phụ thuộc vào tính chất di
truyền của vi sinh vật mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi
cấy đặc hiệu, ngoài ra các điều kiện lý hóa trong quá trình nuôi cấy cũng đóng
vai trò quan trọng.
- Những yếu tố ảnh hưởng: thành phần môi trường, tính chất cơ lý của
môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí nhiệt độ và pH môi
trường.
- Có hai phương pháp nuôi Vi sinh vật:
+ Nuôi vsv tạo α -amylase bằng phương pháp bề mặt
+ Nuôi vsv tạo α -amylase bằng phương pháp bề sâu.
- Quy trình công nghệ sản xuất α –amylase từ Asp.oryzase

10


Quy trinh công nghệ.
Phương pháp thu nhận từ động vật: 98% tụy tạng được cấu tạo từ tế bào
ngoại bào tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết enzyme tiêu hóa vào
trong tế bào.
d. Ứng dụng trong sản xuất bia.
Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống các nước phương Tây chủ yếu
sử dụng enzim α –amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt , sau đó
đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces . Cơ sở khoa học của việc
sử dụng malt là khi đại mạc chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm,
enzyme α –amylase sẽ được tổng hợp và enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có
trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự nảy mầm.
Enzyme α –amylase tác động vào giai đoạn đường hóa biến đổi tinh bột

Cấu tạo:
Enzyme β- amylase là một albumin
Tâm xúc tác của nó chứa nhóm– SH và – COOH cùng với vòng imizadol của

-

các gốc histidin
Là một enzyme ngoại phân( exoenzyme), có ái lực với các liên kết 1,4-

c)
d)
-

glycodise các đầu không khử của một mạch liên kết – 1,4 glycodise
Nguồn gốc:
Chỉ phổ biến ở giới thực vật, đặc biệt có ở hạt nảy mầm (malt)
Trong vi khuẩn thì không có
Còn trong nấm sợi( nấm mốc) thì cho đến nay vẫn chưa chứng minh hoàn toàn
Tác dụng trong quá trình sản xuất bia:
Chủ yếu trong giai đoạn đường hóa: biến đổi tinh bột thành các dextrin và

-

maltose
Cơ chế:
12


+ Enzyme β- amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết 1,4 – glucan trong
tinh bột, glycopen và saccharide, phân cắt tuần tự từng nhóm maltose từ đầu



trong trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase bao gồm acid glutamic,
tryptophan, tyrosin, asparagin, acid aspatic, lysin, serin. Trong đó acid glutamic
ở vị trí thứ 179 và 400 đóng vai trò chính trong việc xúc tác thủy phân liên kết O
– glucozit của cơ chất.

Sơ đồ cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase
b. Cấu trúc không gian enzym glucoamylase
Trong không gian, phân tử glucoamylase được chia làm ba vùng với chức
năng riêng biệt:
- Vùng SBD (Starch binding domain: vùng gắn kết với tinh bột) có kích
thước khoảng 30 A0. Giữ chức năng liên kết với phân tử cơ chất.
- Vùng CD (Catalyse Domain: vùng xúc tác) có kích thước khoảng 60 A0,
giữ chức năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết O – glucozit.
- Vùng Linker có độ dài khoảng 100 A0 liên kết hai vùng trên lại với nhau.

14


Sơ đồ cấu trúc không gian Enzyme Glucoamylase
c. Các tính chất của glucoamylase
Đặc trưng phản ứng: enzyme glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân
liên kết 1,4 – 1,6 o – glucoside và tách tuần tự từng gốc gluco từ đầu không khử
của chuỗi polysaccharide. Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh
bột và tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuổi
polysaccharide. Gốc gluco từ đầu không khử được gọi là glycone, còn chuổi
oligosaccharide sau khi gluco được tách ra thì được gọi là Alglycone.
Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết o – glucozit là do hoạt động chủ yếu
của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với

Cấy giống

Nhân giống

Lên men

Nghiền
Nước

Trích li

Bã

Li tâm

Bã

Siêu lọc UF

Chất độn

Sấy thăng hoa

Phối trộn
Bao bì

Đóng gói

Chế phẩm enzyme


bởi độ ẩm, ta sẽ phải cho nguyên liệu qua máy nghiền.
- Trích li: Mục đích công nghệ: Khai thác, dùng nước để chiết rút enzyme
glucoamylase trong canh trường
17


- Li tâm: Tách sinh khối ra khỏi dung dịch sau trích ly. Li tâm 4 – 5 phút
ở nhiệt độ 15 – 20o C.
Siêu lọc UF: Đây là quá trinh tách và tinh sạch enzyme Dịch thu được sau
khi phân riêng bằng membrane đã được tách một phần nước (cô đặc) chuẩn bị
cho quá trình sắc ký trao đổi ion. Sử dụng thiết bị có áp lực thẩm thấu: 6.9 bar,
đường kinh mao quản trung binh từ 2 đến 50nm.
- Sấy thăng hoa: Mục đích: quá trình sấy sẽ tách bớt nước ra khỏi bán
thành phẩm, chuyển nguyên liệu sang dạng rắn.Bảo quản: quá trình sấy làm
giảm giá trị hoạt độ của nước, ức chế hoạt động của enzyme, chế phẩm enzyme
không bị biến đổi trong quá trình bảo quản.
- Phối trộn Mục đích: giai đoạn này ta trộn các chất bảo quản và chất ổn
định hoạt tính enzyme vào để bảo quản và hoàn thiện sản phẩm.
- Đóng gói: Mục đích: hoàn thiện sản phẩm, dễ dàng trong bảo quản và
vận chuyển, thương mại .
f. Ứng dụng trong quy trình sản xuất bia
Chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus, Rhizopus … được thay
thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất bia từ nguyên liệu có
bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được
hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.
Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng
vai trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường để lên men, do đó
cần chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều enzym glucoamylase.
Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt của
Aspergillus Usamii và Aspergillus Balatae.


Endopeptidase gồm: aminopeptidase và Carboxypeptidase
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một
tripeptid.
+ Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liêm kết peptid ở đầu C của chuỗi

-

polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.
Exopeptidase gồm: Serin proteinase; cystein proteinase; Aspartic proteinase và
Metallo proteinase
+ Serin proteinase: Là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serin
trong trung tâm hoạt động và có vài trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrysin và
19


subtilisin. Các Serin proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể
hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cysteine proteinase thường
hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như : pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động
và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo

Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng

-

cơ thể chúng •ang ngàn lần sau một ngày đêm.
Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được
lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một

-

lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.
Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành,

-

kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.
Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp:
Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi
sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản
xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công

-

nghiệp được.
Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ tiền và dễ
kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi
trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố dinh dưỡng của
môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì thế enzyme được



Đặc tính và cơ chế xúc tác của pullulanase (α-dextrin 6-glucosidase)
Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glycogen,
pululan và các dextrin. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có
ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme. Đặc biệt sự có mặt của hai liên kết α1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt
liên kết này. Do đó pullulan chính là cơ chất lý tưởng của pullulanase, vì nó là
một phân tử không phân nhánh cấu tạo bởi những đơn vị maltotriose (có hai liên
kết α-1,4) liên kết với nhau bằng cầu nối α-,6 glucoside. Pullulanase phân giải
các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có
khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối
nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-amylase và
pullulanase làm dextrin này bị thủy phân hoàn toàn. Pullulanase có pH tối ưu là 5 7, nhiệt độ tối ưu là 10 – 50oC. Ion Ca2+ hoạt hóa các enzyme này, trong khi đó
các ion Hg2+, Zn2+, Cu2+, Ag2+ và Co2+ lại có tác dụng kìm hãm.

c)

Công thức cấu tạo

Cấu trúc không gian của enzyme pullulanase

22


Công thức cấu tạo
d)
-

Ứng dụng trong sản xuất bia.
Tham gia thủy phân liên kết α – 1,6 glucoside các poly vào ligosaccharide
Phân cắt liên kếtα – 1,6 glucoside trong trường hợp liên kết này được bao quanh

-Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như
carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC).
- Cellulase cắt liên kết β-1,4- glucosid trong cellulose, lichenin và các βD-glucan của ngũ cốc.
- Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.
- Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5.
- Nhiệt độ tối ưu từ 40-50 độ C.
- Hoạt tính cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80 độ C trong 10 đến 15 phút.
- Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose,
cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg.
- Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag,
Zn nhưng ở mức độ nhẹ.
- Trọng lượng của enzyme cellulose thay đổi từ 30 -110 KDa (Begunin,
1990; Gilkes và cộng sự, 1991).
c) Nguồn gốc của enzyme cellulase :
• Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:
– Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…
– Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì
mạch đen…
– Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…
• Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật
và các chủng vi sinh vật thường sử dụnglà:
– Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus
candidus…
– Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…
– Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…
24


d)Ứng dụng trong sản xuất bia.
Tham gia phân hủy các polysacharide không phảiglucide