BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN
1101229

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ PTP1B
IN VITRO CỦA CAO VÀ MỘT SỐ CHẤT
PHÂN LẬP TỪ DỊCH ÉP THÂN CÂY
CHUỐI TIÊU (MUSA PARADISIACA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN
1101229

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ PTP1B
IN VITRO CỦA CAO VÀ MỘT SỐ CHẤT
PHÂN LẬP TỪ DỊCH ÉP THÂN CÂY
CHUỐI TIÊU (MUSA PARADISIACA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Phùng Thanh Hương
2. NCS. Ths. Nguyễn Thị Đông
Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa sinh
- Trường Đại học Dược Hà Nội

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. Tổng quan về enzym PTP1B ....................................................................... 3
1.1.1. Danh pháp và phân loại ......................................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc .................................................................................................. 3
1.1.3. Cơ chế xúc tác ........................................................................................ 5
1.1.4. Vai trò của PTP1B trong điều trị đái tháo đường .................................. 6
1.1.6. Các nghiên cứu về chất ức chế PTP1B ................................................ 10
1.2. Cây chuối tiêu ............................................................................................ 12
1.2.1. Vị trí, phân loại .................................................................................... 12
1.2.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................ 12
1.2.3. Bộ phận dùng ....................................................................................... 13
1.2.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây chuối
tiêu .................................................................................................................. 13
CHƯƠNG 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 17
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu ................................................. 17
2.1.1. Nguyên liệu .......................................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 17
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 17
2.1.4. Dụng cụ ................................................................................................ 17
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 18
2.3.1. Phương pháp thu mẫu nghiên cứu ....................................................... 19


2.3.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc giữa mật độ quang và
lượng phosphat tự do ..................................................................................... 20
2.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế PTP1B .................................. 21
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 25
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 26

Ethylacetat

IC50

Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế 50%)

IR

Insulin receptor

IRS

Insulin receptor substrate (cơ chất của Insulin receptor)

MeOH

Methanol

PDK1/2

Phosphoinositide-dependent kinase 1 or 2

PI3K

Phosphatidylinositol 3-kinase

PTP1B

Protein tyrosin phosphatase 1B


Bảng 3.1.

Mật độ quang của các dung dịch Pi

Bảng 3.2.

Khả năng ức chế PTP1B của các mẫu cao từ thân cây
chuối tiêu (Musa paradisiaca L.)

Bảng 3.3.

Khả năng ức chế PTP1B của của các chất phân lập từ thân
cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L.)

Bảng 3.4.

IC50 của các chất có tác dụng nổi bật


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Cấu trúc không gian của PTP1B

Hình 1.2.

Hai giai đoạn của quá trình xúc tác bởi PTP1B

Hình 1.3.



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) typ 2 là typ phổ biến nhất, chiếm xấp xỉ 90% tổng
số ca mắc ĐTĐ. Typ này đặc trưng bởi sự kháng insulin, một hormon được sản
xuất bởi tế bào beta đảo tụy với vai trò duy trì cân bằng glucose nội môi. Trong
con đường truyền tín hiệu của insulin, tín hiệu mà receptor nhận được là kết quả
của sự cân bằng giữa quá trình phosphoryl hóa tyrosin bởi protein tyrosin kinase
và quá trình khử phosphoryl tyrosin bởi các protein tyrosin phosphatase (PTP),
đặc biệt là protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B). Tuy nhiên, nếu tăng hoạt
tính của PTP1B quá mức có thể thay đổi cân bằng giữa 2 enzym, dẫn đến giảm
sự phosphoryl hóa tyrosin và giảm tính nhạy cảm với insulin của tế bào [36].
Trong nhiều nghiên cứu, PTP1B tăng hoạt tính ở cả người bệnh ĐTĐ typ 2 và
động vật thí nghiệm gây ĐTĐ typ 2, ức chế hoạt tính PTP1B làm giảm kháng
insulin, cải thiện kiểm soát glucose máu [6], [41]. Do đó hiện nay, PTP1B được
coi là một đích tác dụng đầy triển vọng của thuốc điều trị ĐTĐ typ 2. Nhiều
dược liệu trên thế giới đã được chứng minh cơ chế tác dụng giảm kháng insulin
thông qua khả năng ức chế PTP1B như rễ cây dâu, cây nhàu, ngũ vị tử... [36].
Cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) được biết đến rộng rãi như một loại
thực phẩm và cũng là một vị thuốc. Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào
dân tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, phần thân
chuối ép lấy nước uống để điều trị đái tháo đường cho kết quả hạ glucose máu
rất tốt. Hiện nay, trên thế giới có một vài nghiên cứu về tác dụng chữa ĐTĐ của
thân cây chuối tiêu nhưng chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất,
chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác
dụng hạ glucose máu của dược liệu này [29], [34]. Để góp phần tìm những bằng


2

Vòng WPD: sự thay đổi hình dạng của PTP1B liên quan đến hoạt động
xúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất. Vòng WPD (acid amin 79-187) di
chuyển tới 12Å để đóng vòng phenyl của cơ chất, làm tăng tương tác kị nước.
Asp181 di chuyển tới vị trí mà nó có thể hoạt động giống một acid phổ biến để


4

chuyển proton cho nhóm tyrosyl rời đi. Arg221 cũng thay đổi vị trí để tối ưu hóa
tương tác “cầu muối” với cơ chất phosphat. Trong quá trình chuyển dạng này,
Cys215 là vị trí liên kết ái nhân vào nguyên từ phospho của cơ chất. Vì vậy tác
nhân ức chế PTP1B có thể tác động vào cả quá trình chuyển dạng “mở” và
“đóng” của PTP1B.
Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp: đây là vị trí xúc tác không hoạt động,
tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do tiếp xúc với môi trường
nhiều hơn. Tuy nhiên vị trí này quan trọng trong thiết kế tác nhân ức chế PTP1B
[31].

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của PTP1B [31].


5

1.1.3. Cơ chế xúc tác
Vùng xúc tác có chứa 3 tiểu phân (cystein, aspatat và glycin) – là 3 acid
amin cần thiết cho quá trình xúc tác.
Giai đoạn 1: Đoạn peptid có chứa phosphotyrosin đi vào vị trí. Tiểu phân
aspatat có vai trò cho proton (gốc phenolat là nơi nhận và nó cũng là nhóm rời
khỏi cấu trúc cơ chất).
Giai đoạn 2: Khi gốc phosphat đã được chuyển đến gốc cystein, cơ chất


7

Hình 1.3: Vai trò điều hòa âm tính của PTP1B trong con đường
truyền tín hiệu của insulin [32].
Một trong những cơ chế của ĐTĐ typ 2 là tình trạng kháng insulin, ảnh
hưởng đến sự vận chuyển và chuyển hóa glucose ở gan, cơ và mô mỡ. Ở cấp độ
tế bào, kháng insulin biểu hiện ở sự giảm đáp ứng với một số lượng cực đại của
insulin hoặc giảm tính nhạy cảm với sự kích thích vận chuyển glucose và chuyển
hóa. Mặc dù khiếm khuyết ở phân tử gây nên sự kháng insulin chưa được biết rõ
tuy nhiên hầu hết các bằng chứng cho thấy có thể nó liên quan đến sự truyền tín
hiệu ở IR. Xuất phát từ cơ chế kết thúc con đường truyền tín hiệu của insulin
bằng phản ứng khử phosphoryl của IR, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các PTP có
liên quan đến tình trạng kháng insulin thông qua tăng hoạt tính hoặc tăng biểu
hiện. Trong các PTP, PTP1B được nghiên cứu nhiều hơn cả, nó có vai trò điều


8

hòa âm đối với hoạt động của insulin ở mô đích. PTP1B phân bố khá rộng, bao
gồm cả các mô đích chủ yếu của insulin như gan, cơ và mô mỡ. Sự biểu hiện quá
mức của PTP1B dẫn đến ức chế IR. PTP1B có khả năng tương tác và di chuyển
tyrosin phosphat từ IR. PTP1B cũng có thể khử phosphoryl của protein IRS qua
đó làm giảm và gián đoạn quá trình truyền tín hiệu của insulin. Nghiên cứu trên
chuột cho thấy rằng, khi bị giảm hoạt tính của PTP1B sẽ làm tăng sự phosphoryl
hóa ở IR và IRS-1 ở mô cơ và gan. Kết quả là chuột đột biến mất gen PTP1B
tăng nhạy cảm với insulin ở mô cơ và gan cũng như giảm được glucose máu
[32].
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym PTP1B
Bên cạnh các yếu tố ảnh hưởng chung đến hoạt tính các enzym, các quá

và serin, có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzym. Insulin gây ra sự
phosphoryl hóa PTP1B tyrosin làm giảm hoạt tính của nó ở cơ xương và mô mỡ
của chuột. Thêm vào đó PTP1B cũng bị phosphoryl hóa ở các đơn phân serin
trong quá trình phân bào và stress. Hơn nữa sự phosphoryl hóa PTP1B (Ser50)
bởi Akt cũng làm giảm hoạt tính xúc tác của enzym và khả năng khử phosphoryl
IR, đó có thể là một cơ chế điều hòa dương tính của tín hiệu insulin.
Quá trình phân giải protein: trong quá trình hoạt hóa tiểu cầu xảy ra quá
trình phân giải gián tiếp PTP1B từ ER, giải phóng enzym hòa tan vào tế bào


10

chất. Sự oxy hóa thuận nghịch PTP1B có thể ảnh hưởng đến sự phân giải protein
[3].
1.1.6. Các nghiên cứu về chất ức chế PTP1B
a) Các chất tổng hợp
Thiazolidindion (TZD) là 1 thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 đang được dùng phổ
biến trên thế giới với cơ chế làm giảm kháng insulin ở các mô ngoại vi và gan.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh TZD ức chế PTP1B thông qua làm giảm biểu
hiện enzym này ở gan và cơ [4].
Một trong những nhóm chất ức chế PTP1B được nghiên cứu đầu tiên và
nhiều nhất là các hợp chất diflorophosphonat. Các hợp chất tương tự có phospho
như phosphonat, monofluromethyl phosphonat, hydroxymethyl phosphonat…
cũng được thử nghiệm khá nhiều. Cơ chế ức chế PTP1B của các hợp chất dạng
này được cho là ức chế cạnh tranh với enzym [12].
Các hợp chất của vanadi từ lâu được coi là có triển vọng trong điều trị
ĐTĐ ở người. Vanadat và pervanadat là 2 chất ức chế PTP1B được nghiên cứu
lâm sàng rộng rãi [5], [33].
Một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế PTP1B
để điều trị ĐTĐ là khả năng ức chế chọn lọc, bởi PTP là 1 họ enzym lớn với

EtOAc (IC50 = 1,04 ± 0,20 μg/mL) [7].
Các hợp chất phenolic phân lập từ lá cây Cyclocarya paliurus (Batal.) có
tác dụng ức chế PTP1B mạnh với IC50 trong khoảng 1,922 ± 0,480 tới 10,50 ±
2,67 µg/mL [39].


12

Dịch chiết EtOAc của cây Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.)
Harms phân lập được hai diphenyl ethers mới và 8 hợp chất đã biết. Tất cả các
hợp chất phân lập được đều có tác dụng ức chế PTP1B. Trong đó 2 hợp chất mới
ức chế PTP1B với IC50 trong khoảng từ 9,2 ± 1,4 đến 12,6 ± 1,2 µM [14].
Tại Việt Nam, một số thảo dược đã được chứng minh tác dụng ức chế
PTP1B và song song là tác dụng điều trị ĐTĐ typ 2 như rễ cây chóc máu, giảo
cổ lam…[2],[36].
1.2. Cây chuối tiêu
1.2.1. Vị trí, phân loại
-

Ngành : Ngọc lan

-

Lớp : Hành

-

Bộ : Gừng

-

- Năm 2010, Suneetha.B và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh được trong
dịch ép quả chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu trên chuột ĐTĐ bởi alloxan
(150mg/kg). Kết quả của nghiên cứu này còn cho thấy dịch ép quả chuối tiêu còn
có tác dụng hạ triglycerid máu, cholesterol toàn phần và chống oxy hóa trên
chuột bị ĐTĐ bởi alloxan [29].
- Năm 2011, Imam. M. Z và cộng sự đã chứng minh được trong quả chuối tiêu
có chứa các sitoindosid (1, 2, 3, 4) và các sitosterol, β-D-glucosid,…Nghiên cứu
này đã chứng minh được tác dụng chống viêm ruột, điều trị tiêu chảy, chống oxy
hóa của quả chuối tiêu xanh [9]. Tiếp theo, năm 2012 Paul. C và cộng sự đã
nghiên cứu dịch ép của quả chuối tiêu chín trên chuột cống trắng. Kết quả cho
thấy sau 28 ngày ở lô chuột được uống dịch ép tác dụng điều hòa miễn dịch thể
hiện khác biệt so với lô không được uống dịch ép (p
n-butanol (p