ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

LA THỊ BÍCH NGỌC

Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ
KHẢ NĂNG SINH CELLULASE, ỨNG DỤNG TRONG
XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH & CNTP
: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

LA THỊ BÍCH NGỌC

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Văn Chí giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình,
chu đáo trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Lương Thị Thu
Hường đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn để em hoàn thành tốt luận
văn tốt nghiệp của mình.
Em xin gửi lời tri ân tới các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công
nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã dìu dắt và truyền đạt cho em không chỉ kiến thức mà cao hơn hết
là đạo đức làm người trong suốt bốn năm học qua.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã luôn
động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành
bản khóa luận này.
Thái Nguyên, tháng năm 2015
Sinh viên

La Thị Bích Ngọc


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng đối với sự phát triển
của vi sinh vật .................................................................................... 11
Bảng 2.2: Một số VSV sản xuất cellulase ...................................................... 15
Bảng 3.1: Các hóa chất được sử dụng trong đề tài nghiên cứu ...................... 32
Bảng 3.2. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ............................................ 32
Bảng 3.3. Môi trường thử hoạt tính Cellulose ................................................ 33
Bảng 3.4. Môi trường CMC ............................................................................ 33
Bảng 3.5. Thuốc thử lugol............................................................................... 34


Chú thích

CMC

: Carboxymethyl cellulose

VSV

: Vi sinh vật

KL

: Khuẩn lạc

OD

: Optical density


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... iv
MỤC LỤC ......................................................................................................... v
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1

2.2.3. Ứng dụng của Enzyme Amylase ........................................................... 23
2.3. Rác thải nông nghiệp................................................................................ 26
2.3.1. Đặc điểm của rác thải nông nghiệp ....................................................... 26
2.3.2. Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải ..................... 27


vi

2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

30

2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 30
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 30
Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 32
3.1 Đối tượng nghiên cứu

32

3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

32

3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng

32

3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 32
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị sử dụng .................................................................. 32

51


vii

4.4. Tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm hàm
lượng dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy ban đầu

52

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 56
5.1. Kết luận .................................................................................................... 56
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 57


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nước ta là một nước nông nghiệp đang phát triển, song song với điều
đó ta có thể nhìn ra sẽ có một lượng lớn những phế phụ phẩm của các lĩnh
vực nông nghiệp được thải ra. Từ xa xưa, người dân đã biết tận dụng những
nguồn phế phụ phẩm để chế biến thức ăn chăn nuôi, hoặc tận dụng vào những
mục đích riêng của mình, phục vụ trong đời sống sinh hoạt hàng ngày. Nhưng
xã hội càng phát triển, nhu cầu của con người ngày một tăng cao, cũng dẫn tới
một lượng phế phụ phẩm mỗi ngày một nhiều hơn, nếu người dân chỉ có thể
tận dụng được phần nào vào cuộc sống, mục đích của mình thì không thể nào
giải quyết được hết lượng phế phụ phẩm còn lại đó.

nhiều nơi, chúng phát triển rất nhanh trong điều kiện khí hậu nóng ẩm ở nước
ta. Trên các thực vật bị mục nát như: gỗ mục, rơm rạ mục… chứa rất nhiều
các chủng nấm mốc có khả năng tạo ra enzyme cellulase để phân hủy
cellulose (Nguyễn Lân Dũng và sc, 1982) [1]. Từ những lý lẽ trên tôi tiến
hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh
cellulase, ứng dụng trong xử lý rác thải nông nghiệp”. Đề tài nhằm ứng
dụng thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và trong nhiều lĩnh vực khác
phục vụ sản xuất nông nghiệp bằng công nghệ vi sinh, góp phần cải tạo độ phì
nhiêu cho đất, bảo vệ môi trường và phát triển bền vững.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu những chủng VSV có khả năng phân
giải cellulose. Nghiên cứu ứng dụng vào chế phẩm sinh học dùng trong môi
trường.
1.3. Yêu cầu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính sinh cellulase cao
từ các mẫu tự nhiên: rơm rạ mục, lá cây, thân gỗ mục...


3

Thử hoạt tính được khả năng phân giải cellulose.
Định danh: định danh sơ bộ về chủng nấm mốc mà mình đã phân lập
được, dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải… đem so với các kết
quả đã được công bố xem nó thuộc chủng loại nào.
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: lựa chọn môi trường thích hợp để có
điều kiện lên men thu sinh khối và thu chế phẩm enzyme
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào
nghiên cứu khoa học.

kitin-glucan, kitozan. Nấm sợi có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này
sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành một đám chằng chịt các
sợi, từng sợi được gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), còn cả đám sợi thì
được gọi là hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha)
không có vách ngang hoặc có vách ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát
triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi
nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ti thể. Hệ sợi nấm phát triển thành các
dạng khuẩn lạc khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. Khuẩn lạc nấm
sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt,


5

nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía
xuyên thâm, hoặc lồi lõm không đều, mép khuẩn lạc trơn, răng cưa… khuẩn
lạc của nấm mốc cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn lạc
nấm mốc khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn, thường to hơn
khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần. Dạng xốp hơn do khuẩn ti to hơn. Thường thì
mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5-10 mm, trong khi đó
khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5-2mm (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3];
(Nguyễn Xuân Thành và cs, 2005) [5].
Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp hình nón, không tăng trưởng và có tác
dụng che chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nấm. Trong sợi nấm chứa chất
nguyên sinh, nhân, các bào quan, các enzyme… Nấm mốc có cấu tạo gồm
khuẩn ty và bào tử.
Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty. Là những sợi nấm phân nhánh phát sinh
từ bào tử mà ra, chiều ngang của khuẩn ty khoảng 3-10µm, chúng có hình thái
khác nhau như lò xo, hình xoắn ốc, hình cái vợt, hình sừng huơu, hình cái
lược, hình lá dừa. Một số sợi nấm phát triển sâu vào cơ chất và hấp thu các
loại dinh dưỡng chứa trong đó. Trong hệ sợi nấm có 2 loại khuẩn ty: khuẩn ty

bào tử được hình thành tuần tự, liên tiếp từ khuẩn ty sinh sản, nghĩa là được
sinh ra bên ngoài các tế bào sinh bào tử, một số khác sinh ra bên trong của các
tết bào sinh bào tử (nội sinh). Các bào tử đính mới sinh ra sẽ đẩy các bào tử
đính cũ ra bên ngoài. Các bào tử đính được sinh ra trên khuẩn ty đặc biệt gọi
là cuống bào tử đính (conidiophore). Bào tử đính có hình dạng và màu sắc
khác nhau tùy theo loài nấm mốc, có thể là hình cầu, hình trứng, hình bầu
dục, hình kim, có thể không màu hoặc nhiều màu khác nhau (nâu, xanh lục,
xám, vàng, đen..). Bào tử đính có thể là đơn bào hoặc đa bào. Chúng có thể
đứng riêng từng cái hoặc xếp thành từng chuỗi, từng khối (Nguyễn Xuân
Thành và cs, 2005) [10].


7

b. Sinh sản hữu tính
Nấm mốc cũng có quá trình sinh sản hữu tính, bao gồm các hiện tượng
chất giao, nhân giao và phân bào giảm nhiễm như ở các sinh vật bậc cao.
Sinh sản bằng bào tử noãn (oospore). Các noãn khí được sinh ra trên đỉnh các
sợi nấm sinh sản. Khi noãn khí chín có chứa một hay nhiều noãn cầu. Hùng
khí (cơ quan giao tử đực) được sinh ra ở gần noãn khí. Khi tiếp xúc với noãn
khí, hùng khí sẽ tạo ra một hoặc vài ống xuyên chứa một nhân và một phần
nguyên sinh chất thụ tinh cho một noãn cầu để tạo thành một noãn bào tử.
Noãn bào tử được bao bọc bởi một lớp màng dày, sau một thời gian phân chia
giảm nhiễm, sẽ phát triển thành khuẩn ty mới.
Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp (zygospore). Khi hai khuẩn ty khác giống
tiếp giáp với nhau, chúng mọc ra hai mấu lồi gọi là nguyên khối nang
(progametangia), các mấu lồi này tiến gần lại nhau, mỗi mấu sẽ xuất hiện một
vách ngăn phân tách hai phần đầu của hai mấu lồi thành hai tế bào đa nhân.
Hai tế bào này sẽ tiếp hợp với nhau và tạo thành một hợp tử đa nhân, có màng
dày bao bọc gọi là bào tử tiếp hợp.

Thành và cs, 2005) [10].
2.1.1.3. Ứng dụng của nấm mốc:
Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, không khí,
nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm. Nấm mốc góp phần quan trọng trong
việc khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, chúng có khả năng phân
giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ phức tạp.
Nấm mốc được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như sau:
• Chế biến thực phẩm như: sản xuất tương, nước chấm, rượu, citric acid…
• Sản xuất enzyme như: cellulase, amylase, protease, pectinase…
• Sản xuất dược phẩm như: penicillin, cephalosporin, steroid…
Ngoài ra, nấm mốc còn được ứng dụng để sản xuất các thuốc trừ sâu
sinh học, kích thích tố tăng trưởng cho thực vật, làm tăng độ phì nhiêu của


9

đất, sản xuất sinh khối nấm sợi phục vụ cho ngành chăn nuôi, sử dụng nấm
mốc để xử lý ô nhiễm môi trường…
Bên cạnh đó nấm mốc cũng là nguyên nhân gây ra nhiều tổn thất lớn
cho việc bảo vệ mùa màng, lương thực, thực phẩm, hàng hóa, vải vóc, dụng
cụ quang học, phim ảnh, sách vở… Nhiều loại nấm mốc gây nên những bệnh
khá phổ biến và khó điều trị ở người, gia súc, cây trồng, các bệnh nấm ở
người như hắc lào, nấm vảy rồng, nấm kẽ chân, nấm phổi, nấm tóc, nấm mào
gà… Đặc biệt có những loại nấm mốc tiết độc tố gây ngộ độc thức ăn như
Aspergillus flavus, gây tổn thất lớn trong chăn nuôi (Nguyễn Lân Dũng và cs,
2005) [3].
2.1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc
a. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Nguồn carbon là nguồn vật chất cung cấp carbon trong quá trình sinh
trưởng và phát triển của nấm mốc. Trong tế bào nấm mốc nguồn carbon trải

Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là tham gia vào thành phần của các
trung tâm hoạt tính của các enzyme, duy trì tính ổn định của kết cấu các đại
phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào,
khống chế điện thế oxi hóa khử của tế bào.


11

Bảng 2.1: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng đối với sự phát
triển của vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3]
Nguyên tố Hợp chất sử dụng Chức năng sinh lý
P

KH2PO4

Là

thành

phần

của

axit

K2HPO4

nucleoproteine,phospholipide,

nucleic,

Ca(NO3)2

enzyme duy trì, cần cho sự xây dựng trạng
thái cảm thụ của tế bào.

Na

NaCl

Là thành phần của hệ thống vận chuyển của
tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, duy trì
tính ổn định của một số enzyme.

K

KH2PO4

Là cafactor của một số enzyme, duy trì áp
suất thẩm thấu của tế bào.

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc còn cần tới một số
nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố này cũng có vai trò rất quan trọng mặc
dù chỉ cần với số lượng rất nhỏ khoảng 10-5 - 10-6 mol/l môi trường nuôi cấy.
Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme và làm hoạt hóa
enzyme. Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt


12

tính sinh lý của nấm mốc bị giảm sút thậm chí ngừng phát triển. Tuy nhiên do

13

chủ yếu được dùng làm coenzyme hay cofactor của các enzyme cần thiết cho
quá trình sinh tổng hợp nucleotide, nucleoside và acid nucleic (Thomas
Nilsson, 1974) [26].
e. Ảnh hưởng của nước
Nước là thành phần không thể thiếu để nấm mốc có thể sinh trưởng.
Chức năng sinh lý của nước trong tế bào vi sinh vật là: Hòa tan và vận chuyển
các chất, hỗ trợ cho việc hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng các sản phẩm
trao đổi chất; Tham gia vào hàng loạt các phản ứng hóa học trong tế bào; Duy
trì cấu hình thiên nhiên ổn định của các đại phân tử protein, acid nucleic…;
Là thể dẫn nhiệt tốt, hấp thu tốt nhiệt lượng sinh ra trong quá trình trao đổi
chất và khuếch tán kịp thời ra bên ngoài để duy trì sự ổn định của nhiệt độ
bên trong tế bào; Duy trì hình thái bình thường của tế bào; Thông qua quá
trình thủy phân hay khử nước để khống chế kết cấu tế bào (kết cấu enzyme…)
Phần nước có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật gọi
là nước tự do. Phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế
bào được gọi là nước liên kết. Nước liên kết mất đi khả năng hòa tan và lưu
động (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1982) [1]; (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003)
[3].
f. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ thấp thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó có tác
động lên khả năng chuyển hóa các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các
enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm vi sinh vật
mất khả năng phát triển và sinh sản. Nhiều trường hợp vi sinh vật sẽ bị chết.
Khả năng gây chết của chúng xảy ra chậm chứ không xảy ra đột ngột như ở
nhiệt độ cao. Dựa vào đặc tính này mà người ta tiến hành cất giữ thực phẩm ở
nhiệt độ thấp, bảo quản giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp.
Nhiệt độ cao thường gây chết cho vi sinh vật một cách nhanh chóng.
Đa số vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ 60-800C ; một số khác chết ở nhiệt độ cao

không gây ảnh hưởng xấu lẫn nhau.


15

Quan hệ đối kháng là hiện tượng mà trong cùng một điều kiện môi
trường có một loài vi sinh vật này trong quá trình sinh trưởng, phát triển sẽ
lấn át loài khác làm cho loài kia bị tiêu diệt. Một số loài vi sinh vật (nấm mốc)
có khả năng tiết chất kháng sinh để tiêu diệt loài khác (Nguyễn Lân Dũng và
cs, 1982) [1]; (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3].
2.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều
kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến
sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp
enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ
khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm
men cũng tham gia quá trình phân giải này. Bảng 2.2: Một số loại vi sinh vật
được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất (Lý Kim Bảng và cs, 1999) [18].
Bảng 2.2: Một số VSV sản xuất cellulase (Lý Kim Bảng và cs, 1999) [18]. [18]
Nấm sợi

Xạ khuẩn

Vi khuẩn

Aspergillus niger

Actinomyces aureus

Preudomonas


Pen. notatum

Act. hygroscopicus

Bacteroides

Trichoderma reesei

Act.ochroleucus

Clos.butiricum

Trichoderma lignorum Act.griseofulvin

Amylophillus sp.

Trichoderma viride

Act.thermofulcus

Clos.locheheadil

Trichoderma

Act.xanthostrums

Cellulosemonas