ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

NGUYỄN THỊ HẠNH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN LAO Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

1


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 12
1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO ..................................................................... 12
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới ....................................................... 12
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam ....................................................... 13
1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN LAO .................................................... 14
1.2.1. Đặc điểm phân loại ......................................................................... 14
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc ........................................................................... 14
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy .......................................................................... 18
1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao ........................................................................ 20
1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO ................................. 28
1.3.1. Phƣơng pháp soi trực tiếp ............................................................... 28
1.3.2. Phƣơng pháp nuôi cấy .................................................................... 28
1.3.3. Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao ............................................ 29

KẾT LUẬN .................................................................................................... 61
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 61
TÀI TIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 62

3


DANH MỤC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

2.1. Các sinh phẩm hóa chất chất chính ......................................................... 34
2.2. Các máy và thiết bị chính ........................................................................ 35
2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu .......................................... 36
2.4. Chu kì nhiệt cho phản ứng multiplex PCR ............................................. 41
2.5. Thành phần phản ứng .............................................................................. 41
2.6. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 .................................... 42
2.7. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 .................................... 43
2.8. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi 23S rDNA ............................... 43
3.1. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Lao và Bệnh
phổi Trung Ƣơng .................................................................................... 47
3.2. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Đa khoa Trung
Ƣơng Huế ................................................................................................ 47
3.3. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Phạm Ngọc
Thạch ....................................................................................................... 47
3.4. Kết quả phát hiện gen đích đặc trƣng ở các chủng lao miền Bắc ........... 49

3.6. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 1mẫu khuyết IS1081 tại miền Trung ... 52
3.7. Kết quả phát hiện mẫu khuyết 23S rDNA ở miền Trung ....................... 53
3.8. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 1mẫu khuyết 23S rDNA tại miền Trung . 54
3.9. Kết quả phát hiện mẫu khuyết IS6110 ở các chủng lao miền Nam ........ 55
3.10. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 3 mẫu khuyết IS6110 tại miền Nam .. 56

5


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.AFB:

Acid Fast Bacilli

2. BCG:

Bacille Calmette-Guérin (Trực khuẩn Calmette-Guérin)

3. bp :

Base pairs (cặp base)

4. DNA:

Deoxyribonucleic acid

5. dNTPs:

Deoxynucleotide triphophates


Mycobacteria Growth Indicator Tube

14. MTBC:

Mycobacteria tuberculosis complex

15.MOTT:

Mycobacteria other than tuberculosis

16. OD:

Optical Density (Mật độ quang học)

17. ORF:

Open Reading Frame (Khung đọc mở)

18. PCR:

Polymerase Chain Reaction

19. PCR-RFLP: Polymerase Chain Reacion – Restriction fragment length
polymorphism (Phân tích đa hình độ dài các đoạn giới hạn dựa trên PCR)
20. PE:

Proline – Glutamine

21. PGL:


7


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin được bày lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
thầy: PGS. TS Nguyễn Thái Sơn, người đã truyền dạy trang bị kiến thức quý
báu, cung cấp nhiều tài liệu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để cho tôi
hoàn thành tốt đề tài luận văn này. Trong suốt thời gian học cũng như thực
hiện đề tài luận văn tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung
tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y tôi luôn được
sự quan tâm giúp đỡ ân cần và hướng dẫn tận tình của thầy. Nhân dịp này
một lần nữa tôi xin được gửi lời cảm ơn, lời chúc chân thành tới thầy cùng
gia đình.
Bên cạnh đó tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các
thầy, cô trong Bộ môn Vi sinh vật, Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên. Các thầy cô đã nhiệt thành trang bị những kiến thức khoa học và
cuộc sống trong suốt thời gian tôi học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể ban lãnh đạo Trung tâm nghiên
cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y, đặc biệt là các thành viên
tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học đã luôn giúp đỡ và tạo điều
kiện tốt nhất để tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã
luôn động viên, khích lệ giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập
và hoàn thành luận văn này.
Mặc dù đã cố gắng hết mình để hoàn thành luận văn này, nhưng chắc
chắn không tránh khỏỉ những sai xót, rất mong được sự tận tình chỉ dẫn và
góp ý quý thầy cô.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 22 tháng 12 năm 2010

đáp ứng đƣợc hai yêu cầu nhanh và chính xác. Ngày nay sự phát triển mạnh

9


mẽ của sinh học phân tử đã tạo ra một bƣớc đột phá trong việc chẩn đoán lao.
Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã rút ngắn
thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống còn hai ngày với độ nhạy và độ đặc
hiệu cao, ngoài ra phƣơng pháp này còn cho phép phân biệt chính xác các loài
có khả năng gây bệnh lao cũng nhƣ phát hiện khả năng kháng thuốc thông
qua các gen đặc trƣng. Hiện nay, trên thế giới và một số cơ sở trong nƣớc
đang ứng dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen IS6110, đây là
trình tự đặc trƣng ở vi khuẩn lao.
Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có những chủng
lao ở Đông Nam Á trong đó có Việt Nam có một tỉ lệ nhất định khuyết các
gen đích này, cụ thể là IS6110 có tỷ lệ khuyết từ 5% đến 8% [25, 30, 32. 40].
Một số nghiên cứu đề xuất chọn các gen đích khác là IS1081 và 23S rDNA
thay cho gen đích IS6110 nhƣng chúng ta chƣa có một nghiên cứu rộng khắp
các chủng lao ở Việt Nam để khẳng định rằng có hay không hiện tƣợng
khuyết gen đích, và nếu có thì tỷ lệ đó là bao nhiêu. Điều này rất quan trọng
vì khi khuyết gen đích thì phản ứng PCR nhằm vào gen đó không có giá trị
chẩn đoán. Nghiên cứu về các gen đích này đồng thời cũng góp phần xây
dựng nên sự hoàn thiện trong việc xác định đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao
ở Việt Nam [13, 30].
Nhận thấy vấn đề này có vai trò quan trọng trong hƣớng phát triển sinh
học phân tử trong việc chẩn đoán lao để có thể thiết kế các bộ kit PCR phù
hợp với đặc điểm riêng của các chủng lao trong cả nƣớc để tránh trƣờng hợp
bỏ sót bệnh nhân.
Từ những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác
định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam”. Đề

đòi hỏi sự vào cuộc của toàn xã hội. Theo thống kê năm 2005 toàn thế giới có
gần 8,8 triệu ngƣời mắc bệnh lao và đã dẫn tới 1,6 triệu ngƣời bị chết.
Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số ngƣời chết do lao ở các nƣớc có thu
nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.
Trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nƣớc có gánh
nặng bệnh lao [54, 69]. Vào năm 2007, WHO ƣớc tính khu vực Đông Nam Á
có số ngƣời nhiễm lao chiếm 34% trên toàn thế giới.
Thông báo gần đây nhất năm 2007 của WHO cho biết bệnh lao bƣớc đầu
đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lƣợng các ca
mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở các khu vực châu Phi,

12


Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn
là mối nguy hại hàng đầu đối với loài ngƣời [54].
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Theo đánh giá của WHO, Việt Nam đứng hàng thứ 12 trong 22 nƣớc có
số bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Tại khu vực Tây Thái Bình Dƣơng,
Việt Nam đứng hàng thứ 3 sau Trung Quốc và Phillipin. Tỷ lệ mắc bệnh
lao tại Việt Nam cao hơn 1,6 lần so với ƣớc tính của WHO, nghĩa là có
khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thể. Theo WHO thì Việt Nam là nƣớc có
gánh nặng bệnh lao cao với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Trong đó tỷ lệ lao
mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000
dân, tỷ lệ tử vong là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh
nhân lao mới là 5% [2].
Theo báo cáo của Chƣơng trình Phòng chống lao quốc gia, hàng năm Việt
Nam phát hiện và điều trị khoảng 100.000 bệnh nhân lao, trong đó 65% là lao
phổi và tập trung ở các vùng đông dân cƣ và thành phố lớn. Bệnh lao ở Việt
Nam đang có xu hƣớng trẻ hóa, rất nhiều thanh niên và ngƣời trong độ tuổi

1.2.2.1. Cấu trúc hình thái
Vi khuẩn lao đƣợc phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trƣớc
đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thƣớc 2-3 µm, dày 0,3 µm. Khi nhuộm
Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất
màu fucsin, do vậy chúng đƣợc gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid
fast bacilli-AFB). Đây là đặc điểm nổi bật của Mycobacteria có thể giúp phát
hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm. Trực khuẩn lao trong dịch huyền
phù duy trì tính kháng axit trong khoảng thời gian rất dài kể cả khi chịu tác
dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần
14


thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme co-factor thiết yếu cho
tế bào [3, 4, 5, 10]

Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis

Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis

[55]

sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [55]

1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào
Cấu trúc thành tế bào của M. tuberculosis chia thành 4 lớp, nhờ đó giúp
bảo vệ tế bào khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát con đƣờng hoà tan giữa tế bào
chất và môi trƣờng.
Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các
phospholipid. Các phân tử phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm ƣa nƣớc
hƣớng về bên trong và nhóm kị nƣớc hƣớng về bên ngoài, quay ra phía vỏ

glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL). Nằm
ngang qua toàn bộ lớp màng là một số glycolipid nhƣ phosphatidylmyoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM),
đƣợc đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào trong đó
LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế bào mycobacteria chứa các protein nằm
rải rác, một vài protein này có tác dụng cấu trúc thành tế bào, một số protein
porin hình thành các kênh ƣa nƣớc cho phép vận chuyển tích cực các chất tan
trong nƣớc thông qua lớp axit mycolic. Porin ở mycobacteria khác so với các
vi khuẩn Gram âm [44, 51].

16


Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi
khuẩn lao phát triển bên trong tế bào, nó có tác dụng tăng cƣờng nhƣ một lớp áo
giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống đƣợc các enzyme phân giải từ các
lysozyme của tế bào [1]. Khi phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy lỏng hoặc
trong đại thực bào, M. tuberculosis tích luỹ một capsule giả không bám. Thành
phần của capsule chứa protein, polysaccharide và lƣợng nhỏ lipid. Cấu thành của
capsule có thể bung ra trong in vivo bên trong các đại thực bào. Màng tế bào của
vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng của các mycobacteria trong cùng
một giống bao gồm cả mycobacteria không gây bệnh.
Màng tế bào của vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể thay đổi
khi phát triển hoặc tồn tại trong các môi trƣờng khác nhau. Trong điều kiện
thiếu oxy thành tế bào sẽ dày lên, sự biểu hiện của các gen mã hoá cho các
porin dƣờng nhƣ đƣợc điều hoà ngƣợc trong các điều kiện môi trƣờng nhất
định nhƣ trong môi trƣờng nuôi cấy axit nhẹ cũng nhƣ trong khoang đại thực
bào. Ngoài ra sự hình thành cấu trúc cord liên quan đến Trehalose 6, 6’dimycolate là một glycolipid chứa hai phân tử axit mycolic bám lỏng lẻo ở
lớp ngoài của thành tế bào. Rất nhiều các hoạt tính sinh học liên quan đến khả
năng gây bệnh, tính sinh độc tố và bảo vệ chống lại đáp ứng của tế bào chủ [3,
4, 11].

Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau mới hình
thành khuẩn lạc điển hình, dạng R.

18


Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trƣờng Lowenstein - Jensen
[www.stanford.edu/.../tb%20culture.jpg]

Trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh phát triển thành các khuẩn lạc xù xì bề
mặt ngoài dính và uốn khúc. Trong khi đó các Mycobacteria không gây bệnh và
các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thƣờng mọc khuẩn lạc
nhẵn, tạo thành đám trong môi trƣờng nuôi cấy [3, 4, 11, 45].
Thời gian phân chia: Ở điều kiện phòng thí nghiệm, M. tuberculosis cứ
12 đến 24 giờ phân chia một lần. Tốc độ phân chia chậm này có thể do tính
thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dƣỡng và
liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Harshey và Ramakrishnan đã xác
định rằng sự tổng hợp RNA là một tác nhân chính liên quan đến thời gian
sống dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA chậm
hơn 10 lần so với E. coli. Hơn nữa, khi trực khuẩn chuyển từ trạng thái ổn
định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên hai lần. Kết quả là tổng
hợp protein bị chậm lại [45].

19


1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao
1.2.4.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis

Hình 1.5. Hệ gen vi khuẩn lao

có thể tạo thành một phức hệ [45, 46, 50].
Trong hệ gen của H37Rv có ít gene với tỷ lệ G+C thấp (
tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này đƣợc mã hoá
bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu nhƣ toàn bộ độ dài của trình
tự chèn.

Hình 1.6. Cấu trúc của IS
- IRL - left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái
- IRR - right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải
- Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình
tự IRR.
- XYZ chứa các trình tự lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình chèn
của IS vào vị trí đích
- p: Promotor định vị trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base ở tận
đầu của IS cần thiết cho sự nhận biết các trình tự chèn thông qua Tpase.
Vùng II chứa các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình tự đặc
hiệu và gắn của Tpase

23


 Các trình tự lặp lại đảo ngƣợc ở hai đầu:
Trừ một vài trƣờng hợp đáng chú ý (IS91, IS110 và họ IS200/605) đa số
các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngƣợc chiều ở hai đầu (IR-Inverted
Repeat) khoảng 10 đến 40 bp. IR đƣợc phân thành hai vùng chức năng, một
định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia
gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển
chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn. Các promoter của IS thƣờng
định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này
có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn
Tpase. Các vị trí gắn các protein đặc hiệu cũng đƣợc tìm thấy bên trong hoặc
ở gần đầu IR, và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase.

nó đƣợc chọn làm gen đích trong phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện
M. tuberculosis [13]. Từ lâu IS6110 đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng rộng
rãi mặc dù trong trình tự genome của M. tuberculosis hơn 30 yếu tố lặp lại
có giá trị nhận diện [52]. Tuy nhiên một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ở
một số vùng trên thế giới các chủng lao có rất ít hoặc thậm chí không có
các trình tự IS6110 [24, 32].

Hình 1.7. 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis

Sự thay đổi về số lƣợng bản copy này là nền tảng của tính đa hình và
thƣờng đƣợc sử dụng trong fingerprinting M. tuberculosis. Những chủng chứa

25