Header Page 1 of 161.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN THỊ THUẬN

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT
ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CHỒI VÀ RA RỄ
CỦA CÂY CHÙM NGÂY TRONG NUÔI CẤY
IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật
Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH

HÀ NỘI, 2016

Footer Page 1 of 161.


Header Page 2 of 161.
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến thầy giáo
PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo
điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 cùng các thầy cô giáo khoa Sinh – Kĩ thuật nông nghiệp, cùng các bạn

Header Page 4 of 161.
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

WHO

: Word Health Organization

FAO

:Food and Agriculture Organzation

ĐHST

: Điều hòa sinh tưởng

NAA

: 1-Naphthalene acetic acid

IAA

: Indol acetic acid

IBA

: Indol butyric acid

BAP

: 6-Benzylamonipurine

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3
1.1. Các chất điều hoà sinh trưởng ở thực vật. .................................................................... 3
1.2. Giới thiệu về cây Chùm Ngây. .......................................................................................... 4
1.2.1. Vị trí và phân loại. ....................................................................................... 4
1.2.2.Nguồn gốc, phân bố ..................................................................................... 4
1.2.3. Đặc điểm thực vật học ...................................................................................................... 5
1.2.4. Giá trị sử dụng cây Chùm Ngây ................................................................................... 5
1.3. Thực trạng gieo trồng và sử dụng cây Chùm Ngây .................................................. 7
1.3.1. Trên thế giới.......................................................................................................................... 7
1.3.2. Ở Việt Nam ........................................................................................................................... 8
1.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Chùm Ngây .................................................. 8
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 8
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam. ........................................................... 10
CHƯƠNG 2: VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................................ 11
2.2. Địa điểm nghiên cứu. ......................................................................................................... 11
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ....................................................................................... 11
2.3.1. Thiết bị ................................................................................................................................. 11

Footer Page 5 of 161.


Header Page 6 of 161.
2.3.2. Dụng cụ................................................................................................................................ 11
2.4. Môi trường nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng ................................................ 11
2.5. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................................. 12
2.6. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................................. 12
2.6.1. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................................. 12
2.6.3. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm. .................................... 16
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 17

Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Chùm Ngây sau 14 ngày
nuôi cấy ............................................................................................................................................ 17
Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP khả năng tái sinh chồi in
vitro cây Chùm Ngây .................................................................................................................. 20
Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi
invitro cây Chùm Ngây. ............................................................................................................. 23
Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BAP + NAA khả năng tái sinh chồi
invitro cây Chùm Ngây .............................................................................................................. 25
Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ của chồi Chùm
Ngây in vitro. ................................................................................................................................. 26

Footer Page 7 of 161.


Header Page 8 of 161.
DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Mẫu vô trùng Chùm Ngây in vitro sống phát sinh chồi sau 14 ngày
theo dõi ................................................................................................................ 18
Hình 3.2. Mẫu vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) .......... 19
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP 0,2 mg/l tới phát sinh chồi ở cây Chùm Ngây in
vitro ..................................................................................................................... 21
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP 0,3 mg/l tới phát sinh chồi ở cây Chùm Ngây in
vitro ..................................................................................................................... 21
Hình 3.5. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BAP khác đến quá trình
tái sinh chồi ở cây Chùm Ngây in vitro .............................................................. 22
Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS tới tạo chồi cây Chùm Ngây in
vitro ..................................................................................................................... 23
Hình 3.7. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng KI 0,3 mg/l đến tái sinh chồi
ở cây Chùm Ngây in vitro ................................................................................... 24

Chùm Ngây chứa hàm lượng dầu cao lên rất khó bảo quản, tỉ lệ nảy mầm thấp,
hiệu quả nhân giống không cao, chất lượng giống không đảm bảo và phụ thuộc
vào mùa vụ. Vì vậy nhằm tạo ra nguồn giống chất lượng cao với số lượng lớn
phục vụ hướng sản xuất hàng hóa đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm nguyên liệu
cho các cơ sở sản xuất dược phẩm, mĩ phẩm, thực phẩm [23],[26]…
Đề tài “Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến
quá trình tái sinh chồi và ra rễ của cây Chùm Ngây trong nuôi cấy in vitro ”
được thực hiện nhằm đáp ứng nhu cầu trên.

Footer Page 9 of 161.

1


Header Page 10 of 161.
2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
2.1. Mục đích
Tạo được mẫu sạch Chùm Ngây in vitro và khảo sát sự ảnh hưởng của các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh chồi và tạo rễ của cây
Chùm Ngây trong môi trường nuôi cấy in vitro
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu khởi đầu mẫu cây Chùm Ngây in vitro
- Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi
- Ra rễ tạo cây Chùm Ngây in vitro hoàn chỉnh.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp, bổ sung dẫn liệu mới về kĩ
thuật nuôi cấy mô tế bào cây Chùm Ngây.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng và

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hoá của cơ quan thực vật,
đặc biệt là sự phân hoá chồi. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng tỉ
lệ giữa auxin (phân hoá rễ) và cytokinin (phân hoá chồi) có ý nghĩa quyết định
trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây
nguyên vẹn. Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ
cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích sự xuất hiện và phát triển của chồi. Để

Footer Page 11 of 161.

3


Header Page 12 of 161.
tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi
cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro [4].
Trong nuôi cấy sử dụng một sô chất như: 6- Benzylaaminopurin (BAP);
Kinetin (Ki); Zeatin(Z);Thidiazuron (TDZ).
1.2. Giới thiệu về cây Chùm Ngây
1.2.1. Vị trí và phân loại
Giới thực vật

: Plantae

Ngành Ngọc lan

: Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan

: Magnoliopsida

diện tích trồng ở nhiều nơi.

Footer Page 12 of 161.

4


Header Page 13 of 161.
1.2.3. Đặc điểm thực vật học
Cây thân mộc cao cỡ trung bình, ở độ tuổi trưởng thành cây có thể mọc cao
hàng chục mét. 1 tuổi nếu không cắt ngọn cây có thể cao tới 5-6m và có đường
kính 10 cm. 3-4 năm tuổi là cây ở độ tuổi trưởng thành. Thân cây óng chuốt,
không có gai. Lá kép dài 30–60 cm, hình lông chim, màu xanh mốc; lá chét dài
12–20 mm hình trứng, mọc đối có 6-9 đôi. Cây trổ hoa vào các tháng 1–2. Hoa
trắng kem, có cuống, hình dạng giống hoa đậu, mọc thành chùy ở nách lá, có
lông tơ, nhiều mật. Quả dạng nang treo, dài 25–40 cm, ngang 2 cm, có 3 cạnh,
chỗ có hạt hơi gồ lên, dọc theo quả có khía rãnh. Hạt màu đen, tròn có 3 cạnh,
lớn cỡ hạt đậu Hà Lan [3],[27].
Cây chùm ngây rất dễ trồng, có thể trồng từ hạt, hom cành, hom củ và
trồng được quanh năm. Vùng thiếu nước nên trồng vào mùa mưa, tức khoảng
tháng 4, tháng 5. Cây được trồng nhiều ở những vùng đất khô hạn khắc nghiệt
nhiệt đới hoặc bán nhiệt đới. Cây chuộng đất ráo nước, nhiều cát, dù là đất xấu
cũng dễ mọc, chịu được hạn hán, ưa nắng, hầu như không bị sâu bệnh hại do đó
chăm sóc cây không cần điều kiện gì đặc biệt về phân bón và nước tưới. Tuy
nhiên cây không chịu được úng ngập và dễ chết nếu không được thoát nước tốt.
Biểu hiện ban đầu của sự dư nước dưới rễ chùm ngây là trên lá cây xuất hiện
những đốm trắng, khi đó người trồng cây cần ngưng tưới hoặc tìm cách thoát
nước cho cây [8].
Gỗ chùm ngây khá mềm, giòn nên thân cành dễ bị gãy trong mưa bão. Do
đó nếu trồng cây để khai thác sử dụng người trồng thường cắt ngọn cây khi đạt

hàm luợng Potassium, Đồng, …và Vitamin B bổ sung cho trẻ

.

Đối với các bà mẹ đang mang thai và cho con bú, chỉ cần dùng 100gr lá
tươi mỗi ngày là đủ bổ sung Calcium, Vitamin C, Sắt , Đồng, Magnesium,
Sulfur, các vitamin B cần thiết trong ngày [20]
Lá được ăn như rau, và ép hoặc sấy khô để phục vụ trong y học, dược cổ
truyền trị nhiều bệnh, hoặc được sử dụn như là gia vị. Hoa sản xuất mật hoa và
có đặc tính kháng viêm. Hạt Moringa rất giàu protein và dầu và được sử dụng để
chăm sóc sắc đẹp cũng như cho các nước thanh lọc. Gỗ cung cấp một loại thuốc
nhuộm màu xanh và được sử dụng làm rào bảo vệ. Cung cấp làm dược liệu để
điều trị các bệnh tiểu đường, bệnh thiếu máu, cầm vết thương khi bị nhiễm trùng
da, là một loại kháng sinh, chữa lành loét dạ dày và chăm sóc mắt. Tại châu Phi,

Footer Page 14 of 161.

6


Header Page 15 of 161.
25g bột moringa được phụ nữ mang thai dùng hàng ngày để cái thiện dinh
dưỡng trước khi sinh [10].
Ở nhiều nước, hạt của các cây Moringa được sử dụng để làm sạch nước.
Các nghiên cứu cho thấy quá trình này làm sạch nước không chỉ loại bỏ các chất
rắn gây ô nhiễm mà còn làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn có hại [11].
Cây Moringa đã được sử dụng để chống suy dinh dưỡng, đặc biệt là ở trẻ
sơ sinh và các bà mẹ cho con bú [17]. Ở châu Phi và Ấn Độ Chùm Ngây được
sử dụng các chương trình chống suy dinh dưỡng. Moringa là một nguồn thực
phẩm đặc biệt rất giàu giá trị dinh dưỡng và khoáng chất, và là cây có lá nhiều

Sri Lanka... Ngoài ra, Mỹ hiện đang là nước nhập nguyên liệu Moriga thô nhiều
nhất, sử dụng trong công nghệ mĩ phẩm cao cấp, nước uống dinh dưỡng và quan
trọng hơn là chiết xuất thành nguyên liệu tinh cung ứng cho công nghiệp thức
phẩm, dược phẩm hóa chất [16].
1.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, Chùm Ngây (Moringa oleifera L.) là loài cây duy nhất của
Chi Chùm Ngây (Moringa) được phất hiện mọc hoang từ lâu đời tại nhiều nơi:
Thanh Hóa, Ninh Thuận, Bình Thuận, ngoài ra còn được trồng ở nhiều nơi Đà
Nẵng, Khánh Hòa, Kiên Giang và đảo Phú Quốc. Cho đến nay, Chùm Ngây
được trồng chủ yếu nhiều ở tỉnh phía Nam để làm rau và dược liệu [23].
1.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Chùm Ngây
Chùm Ngây được xem là cây đa công dụng, rất hữu ích tại các quốc gia
nghèo. Vì vậy, nó được nghiên cứu rất nhiều về nhân giống, trồng trọt và thu
hái; cũng như nghiên cứu về các hoạt tính y dược học và giá trị dinh dưỡng.Đa
số nghiên cứu được thực hiện ở Ấn Độ, Phipipines và Châu Phi nghiên cứu rất
nhiều về giá trị cây Chùm Ngây
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu nhân
nhanh giống cây Chùm Ngây, tập trung chủ yếu ở các nước Châu Á đặc biệt là
Phipipnies. Dưới đây một số công trình nghiên cứu nổi bật:
- Manohar SK (2008) đã nghiên cứu nhân nhanh Chùm Ngây thông qua
mô sẹo. Những mẫu hạt vô trùng và cây con Chùm Ngây trong nhà kính khác
nhau đã được kiểm tra ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đối với sự
tạo thành mô sẹo và khả năng tái sinh. Những mẫu thu thập từ những cành thấp

Footer Page 16 of 161.

8




9


Header Page 18 of 161.
- Marla Magana (2012) tại sở Khoa học, Khoa Khoa học và Công nghệ,
Đại học Belize đã nghiên cứu sự phát triển và chuẩn hóa phương pháp nuôi cấy
in vitro trong lĩnh vực cấy trồng cây Chùm ngây. Kết quả nghiên cứu mẫu sau
xứ lí vô trùng được cấy chuyển vào môi trường MS. Mẫu chỉ xử lí NaClO thì tỉ
lệ mẫu nhiễm cao 62%, còn mẫu xử lí cả NaClO và C2H6O tỉ lệ mẫu nhiễm thấp
45%. Đặc biệt kết quả nghiên cứu này rất hữu ích trong nhân giống in vitro cây
Chùm Ngây khi xử lí mẫu cấy với NaClO 4% cùng ngâm với C2H6O 70% hiệu
quả trong giảm tỉ lệ mẫu nhiễm [17].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có báo cáo nào về biệc nhân giống
thành công cây Chùm ngây bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Hầu hết sử
dụng hình thức trồng bằng hạt hoặc giâm cành. Những phương pháp này có ưu
điểm là đơn giản, thuận tiện, dễ tiến hành, tuy nhiên có những nhược điểm : Phụ
thuộc vào nguồn cung cấp hạt giống, cây con ban đầu, chất lượng giống không
đảm bảo, hệ số nhân không cao, không thể cung cấp với số lượng lớn
Do hạn chế của phương pháp trồng bằng hạt và giâm cành như trên,
phương pháp nhân giống bằng nuôn cấy in vitro là một lợi thế.

Footer Page 18 of 161.

10


Header Page 19 of 161.
CHƯƠNG 2: VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


Header Page 20 of 161.
2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo
Ánh sáng: 3000 lux
Quang kì: 16 giờ/ ngày
Nhiệt độ phòng: 25oC - 27oC
Độ ẩm trung bình: 70 - 74%
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc
lại.
2.6.2. Phương pháp nghiên cứu
* Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu
Mẫu tự nhiên sau khi thu về, cắt mẫu là đốt thân dài 3 - 4cm, rửa xà
phòng dưới vòi nước chảy, sau đó rửa lại nước sạch 2 - 3 lần.
Tiếp đó đưa mẫu vào tủ cấy, tiến hành khử trùng làm sạch mẫu cấy.
Trước hết khử trùng sơ bộ qua cồn (70% (v/v) rồi rửa nước cất 2 - 3 lần, rửa
mẫu bằng Javen (từ 5 - 15%/5 - 15 phút) rồi rửa lại nước cất 4 - 5 lần, thấm khô,
đưa mẫu vào cấy. Theo bảng 2.1

Footer Page 20 of 161.

12


Header Page 21 of 161.
Bảng 2.1 Công thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu cây Chùm Ngây
Công thức


Mẫu được cấy trên môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) có
bổ sung 30g saccarozơ/l, 7g agar/l, pH =5,8.
Đặt lên giàn cấy và theo dõi tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch, tỉ lệ mẫu sạch
nhưng chết trong 1 tuần.

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)

Số mẫu bị nhiễm
x 100

=
Tổng số mẫu cấy

Tỉ lệ mẫu sạch sống (%)

Tổng số mẫu sạch
=

x 100

Tổng số mẫu cấy

Tỉ lệ mẫu sạch chết (%)

Tổng số mẫu sạch nhưng chết
=
Tổng số mẫu cấy

Footer Page 21 of 161.



CT 3

MS + BAP 0,3 mg/l

CT 4

MS + BAP 0,4 mg/l

CT 5

MS + BAP 0,5 mg/l

CT 6

MS + BAP 0,6 mg/l

CT 7

MS + BAP 0,7 mg/l

CT 8

MS + BAP 1 mg/l

CT 9

MS + BAP 1,5 mg/l

CT 10

CT 2

MS + KI 0,3 mg/l

CT 3

MS + KI 0,5 mg/l

CT 4

MS + KI 0,7 mg/l

* Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BAP + NAA đến quá trình tái sinh chồi in vitro
của cây Chùm Ngây
Thí nghiệm nghiên cứu của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá
trình tái sinh chồi in vitro cây Chùm Ngây là BAP kết hợp NAA với 3 công thức
bố trí như bảng 2.4:
Bảng 2.4. Công thức ảnh hưởng BAP + NAA đến quá trình tái sinh chồi in
vitro cây Chùm Ngây
Công thức
ĐC

Môi trường
MS cơ bản

CT 1

MS + BAP 0,2 mg/l + NAA 0,1 mg/l

CT 2


CT 2

MS + 7g agar + 20g saccarozo

CT 3

MS + NAA 0,3 mg/l

CT 4

MS + NAA 0,5 mg/l

2.6.3. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm
Các số liệu thu được được phân tích thống kê theo các tham số: giá trị
trung bình, độ lệch chuẩn,… Sự sai khác giữa các giá trị trung bình được kiểm
tra bằng phương pháp giới hạn sai khác nhỏ nhất trên chương trình Excel 2010
[2].

Footer Page 24 of 161.

16


Header Page 25 of 161.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân
giống in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác định
phương thức khử trùng khác nhau cho thích hợp. Có loại chỉ cần bóc sạch các

CT 1

66,67%

33,33%

0%

CT 2

68,69%

31,11%

17,78%

CT 3

76,92%

23,08%

7,69%

CT 4

41,18%

58,82%