BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÕNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
*********

TẠ VIỆT HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, BẢO QUẢN, HOẠT HÓA
VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA TẾ BÀO GỐC
MÔ MỠ TỰ THÂN ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN
THOÁI HÓA KHỚP GỐI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÕNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
*********

TẠ VIỆT HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, BẢO QUẢN, HOẠT HÓA
VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ
TỰ THÂN ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN THOÁI HÓA KHỚP GỐI

đề tài cấp Nhà nước cùng toàn thể các thành viên tham gia đề tài đã tận tình
giúp đỡ và hợp tác để tôi có thể hoàn thành luận án.
- Tập thể bác sĩ, điều dưỡng viên Khoa Khớp và Nội tiết, Bệnh viện
Quân y 103 đã động viên và hỗ trợ nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện
đề tài luận án.
- Tập thể cán bộ và nhân viên Bộ môn Khoa Huyết học – Truyền máu,
Bệnh viện Quân y 103 đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.


Xin được chân thành cảm ơn các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp
đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với bố mẹ và anh chị em trong
gia đình, đặc biệt là vợ và hai con đã luôn là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn
thương yêu, khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tình cảm,
tinh thần và vật chất cho tôi để hoàn thành tốt chương trình học tập và thực
hiện thành công luận án này.

Hà Nội, tháng 06 năm 2017
Tác giả

Tạ Việt Hƣng


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong luận án là một phần số liệu trong đề tài
độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐL.2012 G/21: “Nghiên cứu ứng dụng tế bào
gốc tự thân trong điều trị bệnh thoái hóa khớp”. Kết quả đề tài này là thành
quả nghiên cứu tập thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được Chủ


1.1.1. Khái niệm chung và phân loại

3

1.1.2. Cách gọi tên tế bào gốc

6

1.2. Tế bào gốc mô mỡ

8

1.2.1. Cấu trúc, chức năng và thành phần của mô mỡ

8

1.2.2. Khái niệm chung về tế bào gốc mô mỡ

9

1.2.3. Các đặc tính của tế bào gốc mô mỡ
1.3. Bệnh thoái hóa khớp

11
16

1.3.1. Định nghĩa và dịch tễ học bệnh thoái hóa khớp

16

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

39

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

39

2.2.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu

40

2.2.3. Phương tiện nghiên cứu

44

2.2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

46

2.2.5. Thu thập và xử lý số liệu

59

2.2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

59

Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU


3.2.3. Kết quả hoạt hóa TBG mô mỡ bằng HTGTC và ánh sáng đơn

72

sắc lên một số hoạt động của TBG trên in vitro
3.3. Kết quả điều trị của TBG mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân

74

thoái hóa khớp gối
3.3.1. Kết quả lâm sàng

74

3.3.2. Kết quả cận lâm sàng

77

3.3.3. Tính an toàn của phương pháp điều trị thoái hóa khớp bằng

87

TBG mô mỡ tự thân hoạt hóa bởi HTGTC tự thân và ánh sáng đơn sắc


Chƣơng 4: BÀN LUẬN

91

4.1. Đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu

103

4.3. Đánh giá hiệu quả điều trị của TBG mô mỡ tự thân đối với 106
bệnh nhân thoái hóa khớp gối
4.3.1. Đánh giá hiệu quả lâm sàng

108

4.3.2. Đánh giá hiệu quả cận lâm sàng

112

4.3.3. Đánh giá tính an toàn của phương pháp điều trị thoái hóa 118
khớp bằng TBG mô mỡ tự thân hoạt hóa bởi HTGTC tự thân và ánh
sáng đơn sắc
KẾT LUẬN

121

KIẾN NGHỊ

123

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ
ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


CÁC CHỮ VIẾT TẮT


CFU

Colony Forming Unit (đơn vị tạo cụm)

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO

Dimethyl sulfoxide

FBS

Fetal Bovine Serum

HTGTC

Huyết tương giàu tiểu cầu

IGF

Insulin like Growth Factor (yếu tố tăng trưởng giống
Insulin)

IL

Interleukin



TGF

Transforming Growth Factor (yếu tố tăng trưởng chuyển
dạng)

THK

Thoái hóa khớp

TIMP

Tissue Inhibitor Metalloproteinase

TNF

Tumor Necrosis Factor (yếu tố hoại tử khối u)

VAS

Visual Analog Scale (thang hiển thị loại suy đo mức độ
đau)

WOMAC

The Western Ontario and McMaster Universities
Osteoarthritis Index (thang điểm đo mức độ cải thiện
chức năng vận động của khớp)



61

3.4.

So sánh thang điểm VAS và thang điểm WOMAC

62

3.5.

So sánh mức độ đau theo thang điểm VAS giữa hai nhóm

63

3.6.

So sánh mức độ rối loạn chức năng vận động theo thang

63

điểm WOMAC giữa hai nhóm
3.7.

So sánh các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và tốc độ

64

máu lắng giữa hai nhóm
3.8.



Mức độ biểu hiện dấu ấn bề mặt CD90, CD105, CD13,

70

CD34, CD45, HLA-DR trên tế bào nuôi cấy sau cấy chuyển
lần 3 (P3) (n=6)
3.14.

Khả năng bám dính của TBG mô mỡ hoạt hóa và không hoạt

72


hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 42)
3.15.

Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ hoạt hóa và không

73

hoạt hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 6)
3.16.

Số lượng tế bào trung bình mỗi lần tiêm

74

3.17.



3.22.

Tốc độ máu lắng theo thời gian theo dõi

78

3.23.

Đặc điểm tràn dịch khớp trên siêu âm theo thời gian theo dõi

78

3.24.

Giai đoạn tổn thương khớp trên Xquang theo thời gian theo

79

dõi
3.25.

Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu trong xương đùi

79

trên MRI theo thời gian theo dõi
3.26.

Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu ngoài xương đùi

82

đùi trên MRI theo thời gian theo dõi
3.31.

Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại mâm chày trong trên

83

MRI theo thời gian theo dõi
3.32.

Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại mâm chày ngoài trên

83

MRI theo thời gian theo dõi
3.33.

Mức độ tổn thương đại thể sụn khớp trước và sau điều trị

85

3.34.

Mức độ tổn thương vi thể sụn khớp trước và sau điều trị

85

3.35.

62

3.2.

Tỷ lệ tế bào sống của SVF trước và sau khi bảo quản

67

3.3.

Biến đổi điểm đau theo thang điểm VAS theo thời gian

75

theo dõi
3.4.

Biến đổi mức độ đau theo thang điểm VAS của nhóm

76

nghiên cứu
3.5.

Biến đổi chỉ số Circularity ở nhóm nghiên cứu

84


DANH MỤC CÁC HÌNH

1.5.

PKCδ là nút tín hiệu của nhiều con đường gây THK

25

2.1.

Sơ đồ nghiên cứu

40

2.2.

Thước đánh giá thang điểm đau VAS: mặt bệnh nhân quan

43

sát
2.3.

Thước đánh giá thang điểm đau VAS: mặt số thầy thuốc

43

đánh giá
2.4.

Tiêm dung dịch Tumescent


49

2.10.

Thu thập hỗn dịch chứa SVF

49

2.11.

Ly tâm tách SVF

49

2.12.

Ly tâm, chuyển lớp huyết tương và buffy coat

50

2.13.

Hoạt hóa HTGTC bằng Calcium Activator Solution

50


2.14.

Hoạt hóa TBG mô mỡ và HTGTC tự thân bằng máy chiếu


Nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ

69

3.3.

Hình ảnh TBG mô mỡ nhuộm Giemsa

70

3.4.

Kết quả phân tích biểu hiện một số dấu ấn bề mặt của TBG

71

mô mỡ sau khi cấy chuyển lần 3 (P3)
3.5.

Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ

72

3.6.

Khả năng tạo CFU-F của 6 mẫu TBG mô mỡ hoạt hóa và

73


thay khớp… có thể đưa tới các biến chứng sau phẫu thuật như tắc mạch,
nhiễm khuẩn hay xa hơn là lỏng khớp. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra
một phương pháp mới, thực sự tác động tới quá trình phục hồi sụn là một việc
làm cấp thiết nhằm đem lại kết quả cao trong điều trị bệnh.
Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy công nghệ tạo các mô với việc
sử dụng tế bào gốc phôi hoặc tế bào gốc trưởng thành có tiềm năng điều trị to
lớn, đặc biệt các tế bào gốc trưởng thành tự thân phù hợp về miễn dịch không
gây những vấn đề đạo đức như sử dụng tế bào gốc phôi và đã được chứng
minh là an toàn [32]. Hiện nay tế bào gốc trưởng thành có thể được lấy từ
nhiều nguồn khác nhau, trong đó mô mỡ được coi là một nguồn rất tiềm năng
và dễ thực hiện để phân lập tế bào gốc dùng trong điều trị. Các nghiên cứu


đầu tiên được triển khai tại Hàn Quốc và Úc tiêm trực tiếp tế bào gốc tự thân
từ mô mỡ vào khớp để điều trị thoái hóa khớp gối và khớp háng cho thấy biện
pháp điều trị này an toàn và bước đầu có hiệu quả tốt cho người bệnh [88],
[120]. Huyết tương giàu tiểu cầu cũng đã được sử dụng tương đối rộng rãi
trong điều trị thoái hóa khớp nhờ tác dụng của các yếu tố tăng trưởng có
nguồn gốc từ tiểu cầu. Bên cạnh đó hoạt hóa quang bằng ánh sáng đơn sắc
năng lượng thấp cũng có tác dụng kích thích các quá trình tăng sinh và biệt
hóa của tế bào gốc.
Ở Việt Nam, ứng dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị thoái hóa
khớp gối tuy đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhưng mới chỉ dừng ở giai
đoạn thử nghiệm ban đầu, chưa có các nghiên cứu hệ thống về số lượng và
chất lượng của tế bào gốc mô mỡ ở bệnh nhân thoái hóa khớp gối sau phân
lập, bảo quản, hoạt hóa bằng huyết tương giàu tiểu cầu tự thân và ánh sáng
đơn sắc (nuôi cấy phân lập chọn lọc và tăng sinh tế bào gốc mô mỡ, phân tích
dấu ấn bề mặt tế bào, khả năng bám dính của tế bào gốc mô mỡ được hoạt
hóa và không hoạt hóa, khả năng tạo CFU-F trên in vitro…) cũng như đánh
giá hiệu quả điều trị và tính an toàn của phương pháp. Do đó, chúng tôi tiến

Tế bào gốc có thể có nguồn gốc từ phôi, bào thai hoặc từ những cá thể
trưởng thành có các đặc tính chung nhưng khác nhau về khả năng tăng sinh và
biệt hóa.
Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell)
Năm 1998, James Thomson lần đầu tiên phân lập được một loại TBG
phôi tại khối tế bào bên trong của phôi nang (blastocyt) có được nhờ thụ tinh
nhân tạo vì mục đích nghiên cứu. Cùng thời gian đó, Jonhn Gearhart cũng


tách được một loại TBG khác gọi là tế bào mầm phôi (embryonic germ cell)
từ phôi 6 tuần tuổi. Hai loại tế bào này đều có những đặc tính cơ bản chung
của TBG nhưng lại khác nhau về tiềm năng tăng sinh tự tái tạo mà không biệt
hóa khi nuôi cấy trong ống nghiệm. TBG phôi người có khả năng biệt hóa tạo
ra tẩt cả các tế bào có nguồn gốc phát triển từ ba lá phôi như tế bào thần kinh,
tế bào cơ tim, tế bào tạo xương, tế bào gan, tế bào tiền thân tạo máu...[6],
[13], [15].
Tế bào gốc thai (fetal stem cell)
Các TBG thai được thu nhận từ các mô của thai bỏ hay các phần phụ
của thai nhi sau khi sinh như: máu dây rốn, màng bao dây rốn, nước ối, mô
nhau thai, máu nhau thai… Dòng TBG trung mô từ thai có thể phân chia 2040 lần, có thể biệt hóa thành dòng trung mô xương và sụn, các tế bào tạo máu
và tế bào thần kinh [9], [13].
Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell)
Là những TBG có trong các mô của cơ thể sau khi sinh. Giống như
những tế bào gốc khác, TBG trưởng thành có khả năng tạo clon, tự thay mới
và biệt hóa thành những dòng tế bào khác nhau. TBG trưởng thành có ở nhiều
mô, có khả năng duy trì, sinh sản và thay thế những tế bào chuyên biệt do quá
trình thay thế mô sinh lý hoặc phá hủy mô do bệnh lý [6], [13]. TBG trưởng
thành có thể sinh ra những loại tế bào chuyên biệt của mô mà mô đó chính là
nguồn gốc nguyên ủy của nó. Gần đây nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng
những TBG của một cơ quan tổ chức có thể tạo ra những tế bào biệt hóa vượt

với những TBG phôi và thai.
Những TBG có nguồn gốc khác nhau cũng không giống nhau về khả
năng phát triển trong môi trường nuôi cấy. TBG thai người có thể tạo ra trong
phòng thí nghiệm với một số lượng rất phong phú và có thể tăng sinh nhưng
vẫn giữ nguyên trạng thái chưa biệt hoá qua nhiều thế hệ. Trên thực tế nghiên
cứu và ứng dụng lâm sàng, khả năng tạo ra một số lượng lớn tế bào từ một


TBG thai sẽ hết sức có ý nghĩa. Những thông tin về định hướng biệt hoá TBG
bào thai thành những tế bào chuyên biệt có những chức năng đặc hiệu chủ yếu
dựa trên những nghiên cứu ở những dòng tế bào thai chuột hoặc người nuôi cấy
in vitro. Ngược lại những hiểu biết về biệt hoá của TBG ở các cá thể trưởng
thành có được là nhờ quan sát trên những mô hình cấy ghép hỗn hợp các tế bào
gốc trên động vật thực nghiệm. Tuy nhiên, đối với những TBG trưởng thành rất
khó có thể tìm ra được những điều kiện thích hợp trong phòng thí nghiệm để
cho những TBG này có thể tăng sinh mà không biệt hoá.
Chức năng chính của TBG trong các mô trưởng thành là sửa chữa và tái
tạo các mô nơi chúng cư trú. Các TBG trưởng thành có khả năng tự tái tạo ra
chính nó và biệt hóa thành ít nhất một loại tế bào trưởng thành. Trong điều
kiện bình thường, các TBG phân chia để tạo thành các tế bào tiền thân, các tế
bào tiền thân này tùy theo từng mô mà trải qua một số lần phân chia tế bào và
quá trình biệt hóa để tạo nên một mạng lưới các tế bào trưởng thành [13].
1.1.2. Cách gọi tên tế bào gốc
1.1.2.1. Theo tiềm năng biệt hóa
- Tế bào gốc toàn năng (totipotent): là loại TBG xuất hiện đầu tiên của
cơ thể người khi trứng được thụ tinh với tinh trùng, ở giai đoạn phôi dâu
(blastomeres). Các tế bào này có tiềm năng cao nhất để biệt hóa thành tất cả
các tế bào, qua đó hình thành được một bào thai hoàn chỉnh [13].
- Tế bào gốc vạn tiềm năng (pluripotent): là các tế bào được phân lập từ
khối tế bào bên trong (inner cell mass - ICM) ở giai đoạn phôi nang

- Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell): là TBG được phân lập từ
các mô trưởng thành trong cơ thể: tủy xương, máu, giác mạc, gan, da, dạ dày,
mô mỡ, tụy… TBG trưởng thành bao gồm tế bào gốc dòng sinh dưỡng


(somatic line) và dòng sinh dục (germ line). Các TBG này có khả năng tạo
clon, tự đổi mới và biệt hóa thành những dòng tế bào khác nhau.
1.1.2.3. Theo kiểu tế bào biệt hóa
Tế bào gốc cũng được gọi theo kiểu biệt hóa của chúng như: TBG cơ
tim sẽ biệt hóa thành tế bào cơ tim, TBG xương biệt hóa thành tế bào xương,
TBG tạo máu sẽ biệt hóa thành các tế bào máu… Một số tác giả cho rằng
những TBG chỉ tạo ra một hay vài tế bào (như cách gọi trên) là những tế bào
tiền thân (progenitor cell), hay cơ chất (precursor cell) vì chúng chỉ biệt hóa
mà không có khả năng tự làm mới. Các ý kiến khác lại cho rằng, tế bào tiền
thân là tế bào ít tiềm năng (nhiều tiềm năng, vài tiềm năng…) nhưng vẫn
được gọi là TBG [13].
1.2. TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ
1.2.1. Cấu trúc, chức năng và thành phần của mô mỡ
Mô mỡ là mô liên kết mềm, chứa collagen gắn kết các tế bào với nhau
thành mạng lưới với cấu trúc được chia thành thùy bởi những mạch máu nhỏ.
Chức năng chính của mô mỡ là dự trữ chất béo dưới hình thức triglycerid và
làm nhiệm vụ đệm lót bảo vệ cơ thể. Ngoài ra mô mỡ còn thực hiện chức
năng như một cơ quan nội tiết thông qua việc sản xuất ra một số hormon như
Adiponectin, Resistin, Angiotensin, Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI1), TNFα, IL-6, Leptin, Estradiol (E2) [13].
Mô mỡ chủ yếu nằm dưới da và bao quanh các nội tạng. Trong hệ da,
mô mỡ định cư ở mức độ sâu nhất của da, tạo thành một lớp mỡ dưới da có
tác dụng cách nhiệt. Còn đối với các cơ quan nội tạng, mô mỡ bao quanh như
vật đệm có vai trò bảo vệ. Ở động vật có hai loại mô mỡ: mô mỡ nâu (brown
adipose tissues - BAT) và mô mỡ trắng (white adipose tissues - WAT). Tùy
theo loài mà có số lượng và sự phân bố khác nhau. Mô mỡ nâu gặp chủ yếu ở

cung cấp các TBG đa tiềm năng [13], [56], [57], [80], [107], [117].
1.2.2. Khái niệm chung về tế bào gốc mô mỡ