BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÚY MẬU

Đánh giá độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu
gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và
CYP2C19*17 ở bệnh nhân hội chứng động
mạch vành cấp
Chuyên ngành: Miễn Dịch
Mã số

: 60720106

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. NGUYỄN THANH THÚY
2. TS. VŨ THỊ THƠM


HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan
tâm giúp đỡ của các thầy cô, nhà trường, cơ quan, bệnh viện, gia đình và bè bạn.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS. Nguyễn

nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này.
Hà Nội, ngày 5 tháng 8 năm 2017
Nguyễn Thị Thúy Mậu


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thị Thúy Mậu, Cao học khóa 24, Trường Đại học Y Hà Nội,
chuyên ngành Miễn Dịch, xin cam đoan.
1. Đây là Luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của
PGS.TS. Nguyễn Thanh Thúy, TS. Vũ Thị Thơm.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được
công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 5 tháng 8 năm 2017
Người viết cam đoan

Nguyễn Thị Thúy Mậu


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ACC
AHA

American college of Cardiology: Trường môn Tim mạch Hoa Kỳ
American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ

ADP
CK – MB
COX


Giải trình tự

HCĐMVC

Hội chứng động mạch vành cấp

HDL

High Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử cao

LDL
NMCT

Low Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử thấp
Nhồi máu cơ tim

NTTC

Ngưng tập tiểu cầu

MCV

Mean Corpuscular Volume: Thể tích trung bình hồng cầu

MPV

Mean Platelet Volume: Thể tích trung bình tiểu cầu

PDGF



THA

Tăng huyết áp

TNFα

Tumor necrosis factor α: Yếu tố hoại tử khối u α

RBC

Red Blood Cell: Số lượng hồng cầu

RFLP

Restriction fragment length polymorphism: Đa hình chiều dài đoạn
cắt giới hạn

RLCH
vWF

Rối loạn chuyển hóa
von Willebrand factor: yếu tố von Willebrand

WBC

White Blood Cell: Số lượng bạch cầu



1.3.2.3. Alen đa hình CYP2C19*17 của gen CYPC19..................................18
1.3.2.4. Mối liên quan giữa kiểu gen và hoạt tính enzyme chuyển hóa thuốc 18
1.3.4. Các phương pháp phân tích ứng dụng để phát hiện kiểu gen CYP2C19
.............................................................................................................19
1.3.4.1. PCR-Giải trình tự..............................................................................19
1.3.4.2. PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism).................21
1.3.4.3. RT-PCR (Real-time PCR).................................................................23
1.4. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19
và các yếu tố khác trên bệnh nhân HCĐMVC trên thế giới và trong nước...23
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới........................................................23
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước..........................................................25
CHƯƠNG 2............................................................................................................26
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................26
2.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................26
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân.............................................................26
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ................................................................................26
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.........................................................27
2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................27
2.3. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu.......................................................27
2.3.1. Hóa chất................................................................................................27
2.3.2. Thiết bị..................................................................................................27
2.4. Các bước nghiên cứu....................................................................................28
2.4.1. Quy trình nghiên cứu.............................................................................28
Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ dưới đây:............................28
2.4.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu..........................................................29
2.4.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số....................................29
2.4.4. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, *3, *17 bằng PCR và
kiểm tra chất lượng sản phẩm...............................................................30
2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR.......................................................................32




3.4.2. Kết quả khuếch đại vùng gen chứa 3 alen (CYP2C19*2, CYP2C19*3 và
CYP2C19*17)......................................................................................45
3.4.3. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng phương
pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp GTT...................................45
3.4.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*17 bằng phương pháp GTT......50
Nhận xét..........................................................................................................52
Sau khi đã có được kết quả kiểu gen của cả 3 alen CYP2C19*2, CYP2C19*3
và CYP2C19*17 kết hợp với bảng cách đọc kết quả kiểu gen (bảng 2.7)
đã trình bày trong phần đối tượng và phương pháp nghiên cứu. Chúng
tôi đưa ra bảng kết quả tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 và tỷ lệ phân
loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định như sau.............52
3.5. Mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3,
CYP2C19*17................................................................................................53
3.6. Mối liên quan giữa độ NTTC với các yếu tố khác........................................55
CHƯƠNG 4............................................................................................................58
BÀN LUẬN............................................................................................................58
4.1. Một số đặc điểm chung.................................................................................59
4.1.1. Phân bố theo giới..................................................................................59
4.1.2. Phân bố tuổi theo phân loại chẩn đoán..................................................60
4.1.3. Các yếu tố nguy cơ HCĐMVC.............................................................60
4.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng......................................................................62
4.3. Kết quả đo độ NTTC....................................................................................63
4.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17....64
4.5. Mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3,
CYP2C19*17................................................................................................71
4.6. Mối liên quan giữa độ NTTC với các yếu tố khác........................................73
KẾT LUẬN............................................................................................................76
KIẾN NGHỊ...........................................................................................................77

độ NTTC trong 2 nhóm phân theo tác dụng dược lý được chia theo bảng dưới
đây:......................................................................................................................... 55
Bảng 3.12. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố nguy cơ: Hút thuốc
lá, THA, RLCH lipid, ĐTĐ...................................................................................55


Bảng 3.13. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng: RBC,
WBC, PLT, MCV, CRP, Fibrinogen.....................................................................56
Bảng 4.1. Tần số alen của gen CYP2C19.............................................................68


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Phân bố số lượng bệnh nhân HCĐMVC theo giới.........................40


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của HCĐMVC...........................................................5
Hình 1.2. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [27]............8
Hình 1.3. Giai đoạn bám dính và ngưng tập tiểu cầu.........................................10
Hình 1.4. Một số chất gây ngưng tập tiểu cầu và thụ thể tương ứng.................11
Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC [39].......................12
Hình 1.6. Cơ chế tác dụng của clopidogrel lên quá trình NTTC........................13
Hình 1.7. Mô tả Single nucleotide polymorphisms (SNP)...................................14
Hình 1.8. Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10.....................................16
Hình 1.9. Mô tả vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19
................................................................................................................................. 16
Hình 1.10. Vai trò của Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc....................17
Hình 1.11. Quy trình PCR.....................................................................................19
Hình 1.12. Giải trình tự theo phương pháp Sanger............................................20
Hình 1.13. Giải trình tự gen bằng máy tự động...................................................21

tỉ lệ tương đối đồng đều ở cả hai giới [1]. Vì vậy, để giảm tỉ lệ tử vong cũng như các
biến cố tim mạch cho người bệnh, một trong những điều trị cốt lõi đối với bệnh
nhân hội chứng động mạch vành cấp (HCĐMVC) là chống hình thành huyết khối
thông qua ức chế hoạt động tiểu cầu [3]. Clopidogrel là một thuốc ức chế tiểu cầu
được chỉ định cho bệnh nhân HCĐMVC và can thiệp động mạch vành qua da (PCI).
Kết hợp clopidogrel và aspirin được khuyến cáo là liệu pháp đầu tay trong điều trị
ức chế ngưng tập tiểu cầu thông qua các cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, báo cáo đã
chỉ ra rằng, hiện tượng kháng clopidogrel dao động từ 5% đến 44% giữa các quần
thể khác nhau và trở thành một vấn đề cực kì đáng lo ngại trong thực hành y khoa
[4]. Do đó vẫn còn một tỉ lệ đáng kể bệnh nhân có nguy cơ tử vong, nhồi máu cơ
tim (NMCT), đột quỵ, huyết khối trong stent liên quan đến giảm khả năng ức chế
tiểu cầu của clopidogrel [5].
Clopidogrel là một tiền chất không hoạt tính, để trở thành chất có hoạt tính,
chúng cần được chuyển hóa qua gan thông qua hệ thống cytochrome P450 (CYP 450) và
trong đó có CYP2C19 là enzyme chủ yếu thực hiện chức năng chuyển hóa này. Sau
khi clopidogrel trở thành chất có hoạt tính sẽ ức chế không hồi phục thu thể P2Y12
trên màng tiểu cầu, qua đó làm giảm độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC) [6][7].
Enzyme CYP2C19 có tính đa hình cao, với khoảng 25 alen đã được xác định,
trong đó CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17 là những alen quan trọng nhất
[8]. Đa hình di truyền CYP2C19 (*2, *3) có thể mã hóa thành những dạng enzyme
giảm hay mất chức năng xúc tác trong quá trình chuyển hóa thuốc, do đó thiếu hụt
khả năng chuyển hóa clopidogrel thành dạng chất có hoạt tính vì vậy giảm hiệu quả
kháng tiểu cầu, thất bại trong điều trị và tăng nguy cơ biến cố tim mạch. Hơn nữa,


2

những cá thể mang alen CYP2C19*2 có nguy cơ xảy ra các biến cố tim mạch cao
gấp ba lần so với những cá thể không mang alen này [9]. Mặt khác, những cá thể
mang kiểu gen dị hợp tử hay đồng hợp tử đa hình chứa alen CYP2C19*17 có tốc độ



3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Hội chứng động mạch vành cấp
1.1.1. Định nghĩa
Hội chứng động mạch vành cấp (HCĐMVC) là một thuật ngữ đề cập đến bất
cứ biểu hiện lâm sàng nào có liên quan đến biến cố tổn thương động mạch vành có
tính chất cấp tính, mô tả tất cả bệnh nhân có biểu hiện thiếu máu cơ tim cấp tính,
trong đó bao gồm nhồi máu cơ tim ST chênh lên, nhồi máu cơ tim không ST chênh
lên và đau thắt ngực không ổn định [12].
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh của HCĐMVC
 Quá trình khởi phát của xơ vữa động mạch: vai trò của
nội mô (Hình 1.1.A)
Xơ vữa động mạch (XVĐM) là một quá trình tiến triển do sự hình thành các
mảng xơ vữa ở lớp nội mô của động mạch vừa và lớn, quá trình này xảy ra liên tục
và biểu hiện cuối cùng là thiếu máu cấp tính. Một số yếu tố nguy cơ ảnh hưởng đến
quá trình này bao gồm: cholesterol máu cao, tăng huyết áp, đái tháo đường và hút
thuốc lá [13],[14]. Các yếu tố nguy cơ này tổn thương đến tế bào nội mô của mạch
máu và gây ra rối loạn chức năng nội mô, đóng vai trò chủ chốt trong quá trình khởi
phát xơ vữa động mạch. Rối loạn chức năng nội mô là do giảm hoạt tính sinh học
của nitric oxyde, sản xuất quá mức endothelin, làm tổn thương mạch máu; tăng sự
biểu lộ của phân tử kết dính (như: selectin, phân tử kết dính tế bào mạch, phân tử
kết dính giữa các tế bào) và tăng cường quá trình đông máu thông qua một số chất
hoạt động tại chỗ [15].
 Tiến triển của mảng xơ vữa: vai trò của viêm (Hình 1.1.B)
Chỉ khi tế bào nội mô bị tổn thương, các tế bào viêm đặc biệt là monocyte,
mới đi vào lớp dưới nội mô bằng việc gắn vào các phân tử dính nội mô; ở đó, chúng

lớp nội mô, tế bào viêm và sự hình thành huyết khối trong lòng mạch. Trên hình ảnh
chụp mạch, tổn thương mạch vành không điển hình (hẹp đường kính mạch Sau khi vỡ các mảng bám hay tổn thương lớp nội mô, lớp dưới nội mô lộ ra
(giàu các yếu tố mô và tiền yếu tố đông máu) tiếp xúc với dòng tuần hoàn, sự biểu


6

lộ này gây ra kết dính tiểu cầu do sự hoạt hóa tiểu cầu và ngưng tập, kết quả là tạo
ra cục huyết khối. Có hai loại huyết khối: cục giàu tiểu cầu (hay là cục huyết khối
trắng) hình thành ở vùng có áp lực máu lớn và chỉ làm tắc một phần của động mạch,
cục giàu fibrin (cục đỏ) là kết quả của quá trình đông máu được hoạt hóa và gây



7

 Nhồi máu cơ tim cấp không ST chênh lên [25]
- Lâm sàng: đau thắt ngực hay đau ngực không giải thích được nguyên nhân,
nôn, buồn nôn, khó thở, mệt mỏi, xỉu hoặc ngất…
- Điện tâm đồ (ĐTĐ): ST chênh xuống hoặc sóng T âm.
- Tăng troponin Ic hoặc T, tăng CK toàn phần trên 2 lần so với bình thường và
CK-MB tăng trên 6%
 Nhồi máu cơ tim cấp có ST chênh lên [26]
Do tắc nghẽn hoàn toàn một nhánh chính của động mạch vành (ĐMV). Can
thiệp tái tưới máu cơ tim (bằng thuốc tiêu sợi huyết hoặc nong và đặt stent ĐMV)
nên tiến hành càng sớm càng tốt.
- Lâm sàng: đau thắt ngực kéo dài > 20 phút.
- ST chênh lên ở ít nhất 2 chuyển đạo kế tiếp nhau trên ĐTĐ (>1 mm ở các
chuyển đạo ngoại biên và > 2 mm ở các chuyển đạo trước tim).
- Cơn đau và ST không thay đổi hoặc chỉ thay đổi rất ít khi dùng nitroglycerin.
Nếu không điều trị, sau 4-6 giờ, cơ tim sẽ hoại tử và các men troponin Ic hoặc
T, CK-MB sẽ tăng và sóng Q xuất hiện trên ĐTĐ (NMCT xuyên thành).
Nếu cơn đau thắt ngực không ổn định kéo dài kết hợp với block nhánh trái
trên ĐTĐ thì cũng coi đây là một HCĐMVC với ST chênh lên.
1.2. Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu
1.2.1. Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, không có nhân, đường kính 3-4µm, được sản
xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tuỷ xương.
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy tiểu cầu có một siêu cấu trúc phức
tạp gồm lớp màng bao bọc quanh tiểu cầu. Màng tiểu cầu gồm 2 lớp lipid kép bao
quanh tiểu cầu, trong đó có các glycoprotein đóng vai trò quan trọng như các
receptor bề mặt và là nơi diễn ra một số hoạt động đông máu của tiểu cầu [27].