ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------

LƯU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN
LOÀI CỦA NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)
TRONG ĐẤT TRỒNG NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------

LƯU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN
LOÀI CỦA NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)
TRONG ĐẤT TRỒNG NGÔ

Chuyên ngành:

Vi sinh vật học

Mã số:


trình thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo của Bộ môn Vi sinh vật, Khoa
Sinh học, Trường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã
tận tình dạy dỗ và giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu.
Tôi xin phép gửi lời cảm ơn tới Khoa Kiểm định Vắc xin Vi rút, Viện Kiểm
định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế, là nơi tôi công tác đã tạo mọi
điều kiện cho tôi để tôi hoàn thành Luận văn này.


Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên, hỗ
trợ, dõi theo các bước tiến và chia sẻ với tôi mọi mặt trong cuộc sống và công việc.
Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới bố mẹ và gia đình đã luôn
bên cạnh, ủng hộ và đồng hành cùng tôi và cho tôi ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 02 tháng 1 năm 2018
Học viên

Lưu Thị Dung


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN....................................................................................3
1.1 Nấm rễ nội cộng sinh......................................................................................3
1.2 Lịch sử nghiên cứu.........................................................................................3
1.3 Phương pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh.................................................4
1.3.1

Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh...................................................4


1.7.2

Đặc điểm tự nhiên của Thường Tín - Hà Nội......................................19

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..................................21
2.1 Đối tượng nghiên cứu...................................................................................21
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................................21
2.3 Vật liệu và trang thiết bị...............................................................................21
2.3.1

Nguyên vật liệu....................................................................................21

2.3.2

Dụng cụ...............................................................................................22

2.4 Phương pháp.................................................................................................22
2.4.1

Lấy mẫu đất.........................................................................................22

2.4.2

Phân lập AMF.....................................................................................22

2.4.3

Tiệt trùng các bào tử AMF..................................................................23

2.4.4

- ADN (Acid deoxiribonucleic): Axit deoxiribonucleotit
- ARN (Acid ribonucleic): Axit ribonucleotit
- AMF(Arbuscular Mycorrhizal Fungi): Nấm rễ nội cộng sinh
- BP (Base pair): Cặp bazơ
- dNTP ( Deoxynucleotide Triphosphates): Nucleotide
- PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng khuếch đại


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại AMF về hình thái học................................................................7
Bảng 2.1. Danh sánh mẫu đất trong nghiên cứu......................................................21
Bảng 2.2.Thành phần của phản ứng PCR................................................................25
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR.............................................................26
Bảng 3.1. Số lượng bào tử AMF phân lập...............................................................28
Bảng 3.2. Tần suất xuất hiện của các chi AMF........................................................47
Bảng 3.3. Tần suất xuất hiện của các loài AMF.......................................................49
Bảng 3.4. Sự phân bố của AMF trong đất theo mật độ loài (SR)...........................51


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vị trí địa lý của Duy Tiên - Hà Nam trên bản đồ.....................................19
Hình 1.2. Vị trí địa lý của Thường Tín-Hà Nội trên bản đồ.....................................20
Hình 3.1. Biểu đồ mật độ bào tử AMF phân lập các mẫu ở Hà Nội và Hà Nam......29
Hình 3.2. Hình ảnh bào tử loài Acaulospora gerdemanii (kích thước bar 100µm). .30
Hình 3.3. Hình ảnh bào tử loài Acaulospora longula, kích thước bar 30 µm..........31
Hình 3.4. Hình ảnh bào tử loài Acaulospora mellea, kích thước bar 20 µm............31
Hình 3.5. Hình ảnh bào tử loài Acaulospora morrowiae, kích thước bar 50 µm.....32
Hình 3.6. Hình ảnh bào tử loài Acaulospora rehmii phân lập, kích thước bar 50 µm....32
Hình 3.7. Hình ảnh bào tử loài Acaulospora sp. 1, kích thước bar 30 µm...............33

Nấm rễ nội cộng sinh (AMF - Arbuscular Mycorrhizal Fungi) là một nhóm
nấm có lợi trong đất và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao. Đây là quần
hợp nấm - thực vật được biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình
phát triển của thực vật cũng như hệ sinh thái. AMF được phát hiện từ ít nhất 400
triệu năm trước, có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển, sinh sản của cả thực
vật và nấm. Đây được xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây
trồng, được tìm thấy trong hầu hết các sinh cảnh trên toàn thế giới và trong khoảng
90% các loài thực vật [74]. Mặc dù là nội cộng sinh bắt buộc nhưng mối quan hệ
giữa nấm và thực vật được được coi là mối quan hệ “Hội sinh”, do nó mang lại lợi
ích cho cả vật chủ và nấm. Trước hết, nấm nhận được các sản phẩm quang hợp từ
thực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lưới
hệ sợi nấm trong vùng bầu rễ để tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dưỡng
và cung cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đất
khác, đồng thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nước và chất dinh dưỡng như phốt
pho, lưu huỳnh, nitơ và các vi chất dinh dưỡng từ các sợi nấm tạo ra ngoài vùng rễ.
Ngoài ra, sự cộng sinh của nấm đã được chứng minh là giúp cho cây trồng có khả
năng chống chịu được sự khô hạn hay đề kháng với một số tác nhân gây bệnh
[55,57].
Cây ngô là nhóm cây chủ lực của Việt Nam, đứng thứ hai sau cây lúa. Tuy
nhiên, sự đa dạng nấm AMF trong đất trồng ngô ở Việt Nam cũng như mối tương
quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng
nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô còn chưa được nghiên cứu nhiều. Việc
nghiên cứ sự có mặt của AMF trong đất trồng ngô sẽ góp phần làm rõ hơn về sự đa
dạng của nhóm nấm này trên cây ngô. Đồng thời, từ kết quả nghiên cứu có thể lựa
chọn được những loài ưu thế, tìm hiểu được vai trò và có những đặc tính của AMF
trong việc ứng dụng nâng cao năng suất cây trồng.

1



quan hệ tương hỗ, nấm rễ giúp thực vật lấy dinh dưỡng như photpho, sulfur,
nitrogen và các vi lượng từ đất. Sự cộng sinh của nấm làm cải thiện khả năng hấp
thụ và tuổi đời rễ, tăng cường hấp thu các dinh dưỡng đặc biệt là phốt phát và giảm

3


khả năng nhiễm bệnh của cây [55,57]. Các nấm này đồng thời cũng giảm những ảnh
hưởng gây ra bởi các vi sinh vật nhiễm vào rễ, đất mặn, hay bởi nước tù [46].
1.2 Lịch sử nghiên cứu
Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên được Frank - nhà bệnh cây lâm nghiệp
người Đức đưa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm
ngoại cộng sinh. Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza
(rễ). Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội
cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng được gọi là
“Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc
cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae.
Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của
hình thức cộng sinh này. Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên
trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V).
Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thường được
quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A). Do vậy, tên gọi “Vesicular - Arbuscular
Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) được hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây.
Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi
“Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [26].
Những nghiên cứu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các
chi nấm AMF, còn sự hình thành thể V không thấy có mặt ở tất cả nấm nội cộng
sinh. Do vậy, loại hình cộng sinh này còn có tên gọi là “Arbuscular Mycorrhiza” tuy
nhiên tên này vẫn chưa hoàn toàn thống nhất.
Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 được tổ chức tại Bồ

1990 [51,62].
1.3.2 Phân loại
1.3.2.1 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái học
Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trước hết phải kể đến việc hình
thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả
năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ

5


này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung. Đây là thời điểm để
hoàn thiện sự phân loại và phương pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF.
Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học) đã
đưa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm tế bào
chất [53]. Tuy nhiên, khi áp dụng phương pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra
rằng nhóm Endogone có số lượng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã
chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh là Endogone, Modicella,
Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong
đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới). Với hệ thống phân loại của
Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Ấn Độ đã phân
lập từ đất vườn ươm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và
1 chi không cộng sinh (Endogone) [36].
Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đưa 5 loài AMF ra khỏi chi
Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [71], đến năm 1987 Walker cũng
đề xuất như trên [74]. Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào
3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae,
Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này được đặt trong bộ mới Glomales [52]. Thông
thường, việc phân loại nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái
và cấu trúc của các loại bào tử. Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo
hình thái là bảng màu của Morton [51]. Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang

Tên loài

Hình dạng

aggregatum

Hình cầu, hình trứng,
có cuống nhỏ

ambisporum
marcaropus
appendicula
delicate
dilatata

Acaulospora
myriocarpa
bireticulata
lacunose
Entrophora

colombiana

Màu sắc
Có mầu nâu, mầu
nâu đỏ, một số có
mầu vàng nhạt

Kích thước (µm)


cầu
đậm
Hình cầu, có quả bào
Có mầu nâu, đen
tử
Có quả bào tử, hình
Có mầu nâu hoặc nâu
cầu hoặc gần
nhạt
hình cầu.
Hình cầu, dạng quả
Có mầu nâu nhạt
lê
hoặc vàng nhạt
Có mầu nâu hoặc nâu
Hình cầu
nhạt
Hình cầu hoặc hình
Có mầu nâu nhạt
trứng
hoặc mầu vàng nhạt

8

Thành bào tử mỏng,
có quả bào tử
Thành bào tử dày, 16µm

100-175



Màu sắc
Có mầu nâu nhạt
hoặc mầu vàng

Kích thước (µm)

schenckii.

Hình cầu ,hình tròn

coccogena

Bào tử có dạng hình
cầu, gần hình
cầu, elip

Có mầu nâu nhạt

100-150

coremioides

Bào tử có hình cầu,

Có mầu nâu, nâu
đậm

120-180


Có mầu vàng nhạt

9

150-200

Đặc điểm
Thành dày chia bào
tử thành 3 lớp
Thành bào tử mỏng
có 2 lớp
Thành bào tử có 3
lớp,chia làm 2
nhóm
Thành bào tử có
cấu trúc kiểu liên
tiếp, gồm nhiều lớp

120–160

Thành bào tử có 3
lớp chia làm 2
nhóm

120-150

Thành bào tử có
cấu trúc nối tiếp,
gồm 3 - 5 lớp


10


18S của rARN được công bố dùng để phát hiện và nhận dạng AMF. Trình tự mồi
PCR đã được chứng minh có độ đặc hiệu tốt hơn và bao phủ được tất cả các loài
AMF đã được biết đến [43].
1.4 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh đối với thực vật
1.4.1 Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng
Hệ sợi nấm cộng sinh phát triển xung quanh vùng rễ giúp làm tăng diện tích
bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng của cây trồng. Đối
với các chất dinh dưỡng kém di động (như ion phốt phát, đồng, kẽm…), cây trồng
hút các ion này nhanh hơn khả năng khuyếch tán của chúng trong dung dịch đất nên
thường hình thành vùng hẹp cạn kiệt xung quanh rễ. Khi đó, hệ sợi nấm nhanh
chóng dài ra, vượt qua vùng cạn kiệt để đến với nơi có dinh dưỡng dễ phân giải. Do
có đường kính nhỏ hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trong
đất, kể cả các lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua được để thu nhận chất dinh dưỡng
cung cấp cho cây. Ví dụ, như trong trường hợp phốt pho bị cố định chặt, sợi nấm
cộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các axít hữu cơ để sau đó có thể đổi chỗ cho phốt
pho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại) bằng phản ứng trao đổi, hoà tan
oxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung dịch, do vậy ngăn chặn được sự kết tủa
của phốt phát kim loại. Nấm cộng sinh Mycorrhiza còn giải phóng phốt pho vô cơ
thông qua khoáng hoá chất hữu cơ (thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ). Các
hình thức cộng sinh ở Ericoid Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quan
trọng trong việc khoáng hoá nitơ. Chỉ cần một lượng nhỏ AMF có thể huy động
dinh dưỡng từ khối lượng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lượng lignin và
tannin cao) [29,38,57,67].
1.4.2 Thu nhận hợp chất cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza
Dòng cacbon có thể theo một chiều từ cây xuống AMF hoặc theo chiều
ngược lại do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất. Dòng chảy cacbon từ
cây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF xâm nhiễm vào rễ

rễ cây, sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic), cạnh tranh dinh dưỡng với vi
sinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức đề kháng cho cây chủ. Nấm rễ giúp cây
trồng kháng được một số nguồn bệnh trong đất, tiết ra hệ thống đối kháng (induce
plant systemic resistance) ngăn cản sự tấn công do một số vi khuẩn và nấm gây hại
12


từ trong đất, giúp chống lại bệnh bạc lá sớm trên cây cà chua do Alternaria solani
gây ra thông qua kích thích hoạt động của β-1,3-glucanase, chitinase, phenylalanine
ammonia-lyase (PAL) và lipoxygenase (LOX) có trong lá cà chua [55,67]. Năm
2003, Salem đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nấm rễ và vi khuẩn vùng rễ cà chua
lên sự ức chế với bệnh đốm lá của cây. Kết quả cho thấy, khi chủng nấm rễ kết hợp
với vi khuẩn Pseudomonas làm tăng khả năng ức chế sự phát triển của bệnh và tăng
năng suất cà chua [59]. Song và cs, 2010 đã kết luận rằng, sự cộng sinh của nấm rễ
đối với cây bắp giúp cho cây tiết ra hợp chất 2,4-dihydroxy-7-methoxy-2 H-1,4benzoxazin-3(4 H)-one (Hx) đối kháng với bệnh cháy bìa lá do nấm Rhizoctonia
solani và giúp cây bắp tăng trưởng [68].
1.4.5 Hấp thu lân
Deressa và Schenk (2008) nghiên cứu về cây hành tím Allium CepaL và báo
cáo rằng cây hành tím là loài thực vật có hệ thống rễ ngắn, không phân nhánh và
mọc cạn trên bề mặt đất do đó bộ rễ của cây hành tím không thể hút được đầy đủ
nguồn dưỡng chất trong đất đặc biệt là lân (P) và kết quả là năng suất của hành bị
giảm [29]. Nhờ có mối quan hệ cộng sinh với nấm rễ, cây hành có thể chống chịu
được với điều kiện bất lợi của môi trường và gia tăng năng suất củ [24,38,44].
Trong canh tác hành tím theo truyền thống thì năng suất của củ hành tím có tương
quan rất lớn với sự cộng sinh của nấm rễ [34].
1.5 Tình hình nghiên cứu AMF trên thế giới
Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng như một cách
lây nhiễm AMF và đã chứng minh được rằng cây trồng sẽ phát triển nhanh khi có
mặt AMF [37]. Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã chỉ ra rằng, việc
nhiễm AMF làm tăng sinh trưởng của cây táo con từ chồi [53]. Cho đến năm 1968,

chủ [61].
Năm 1983, Hayman đưa ra kết luận số lượng bào tử AMF trong đất là chỉ
tiêu quan trọng để đánh giá mức độ ưu thế của loài. Trong đó ở đất canh tác, số
lượng loài và số lượng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên [47]. Mặt khác theo
Friese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để xác định
số lượng bào tử [41].

14


Năm 1989, Schonbeck đã phân lập được 15 loài thuộc 3 chi khác nhau là:
Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7 loài thuộc chi
Glomus trong đất vùng rễ của cây táo. Trong đất trồng trọt thường xuyên (đất trồng
lúa nước, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác) luôn có số lượng bào tử AMF
cao hơn nhưng thành phần loài của AMF lại thấp hơn so với trong đất tự nhiên. Về
khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF, Schonbeck và
Dehne, 1989 đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là đậu, lúa mạch, lúa mì,
cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dưa chuột, rau diếp, hồ tiêu đã nhận thấy, chúng
làm giảm 40% các bệnh ở rễ thường gặp trên các loại cây chủ này. Kết quả nghiên
cứu về mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy sự có mặt AMF
đã làm tăng đáng kể lượng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm Pseudomonas) [61].
Năm 1991, tác giả Friese và Koske cho rằng tất cả bào tử của AMF đều được
phán tán một cách thụ động với những nhân tố tích cực là gió và động vật [32].
Nhưng theo MacMahon và Warner thì ở những vùng khô hạn, gió là nhân tố quan
trọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF [49]. Còn với những nơi ẩm ướt,
động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu [32].
Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả tương tự khi nghiên cứu khả năng
chống bệnh ở các cây nhiệt đới có AMF (giảm 30 - 45% các tác nhân gây bệnh) [69].
Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và cộng sự, đã chứng minh hiệu quả của
AMF đối với bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra. Đối với bệnh ở rễ gây ra