Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây
nhiễm trên thực phẩm

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến KS. Huỳnh Văn Thành, KS.
Phạm Minh Nhựt đã động viên, giúp đỡ hướng dẫn tôi hoàn thành bản khóa luận tốt nghiệp
này.
Tôi cũng xin cảm ơn quý Thầy cô khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản khóa luận tốt nghiệp này.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã
động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm
nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý
báu đó!
Tp.HCM, ngày 28 tháng 06 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Trần Hải Hoàng

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

i

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây
nhiễm trên thực phẩm

MỤC LỤC
TRANG


SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây
nhiễm trên thực phẩm
2.2.2.3. Phân loại bằng phage.............................................................................................20
2.2.3. Hình thái ....................................................................................................................21
2.2.4. Đặc điểm ....................................................................................................................21
2.2.4.1. Tính chất nuôi cấy..................................................................................................21
2.2.4.2. Tính chất sinh hóa..................................................................................................22
2.2.4.3. Khả năng đề kháng ...............................................................................................22
2.2.5. Sự phân bố .................................................................................................................22
2.2.6. Các yếu tố độc lực .....................................................................................................23
2.2.6.1. Các protein bề mặt và các protein tiết ra môi trường........................................23
2.2.6.2. Các yếu tố xâm lấn................................................................................................24
2.2.6.3. Các yếu tố chống lại sự tự vệ của tế bào chủ ......................................................27
2.2.6.4. Các siêu kháng nguyên .........................................................................................29
2.2.7. Tình hình nhiễm Staphylococcus aureus trên thế giới và Việt Nam hiện nay .....33
2.2.7.1. Tình hình nhiễm S.aureus trên thế giới ...............................................................33
2.2.7.2. Tình hình nhiễm S.aureus tại Việt Nam ..............................................................34
CHƯƠNG III: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP
PHÒNG NGỪA LÂY NHIỄM TRÊN THỰC PHẨM ....................................................36
3.1. Tổng quan .....................................................................................................................36
3.2. Phương pháp truyền thống .........................................................................................36
3.2.1. Môi trường và hóa chất sử dụng .............................................................................36
3.2.2. Phân tích định tính Staphylococcus aureus ............................................................36
3.2.2.1. Phương pháp ..........................................................................................................36
3.2.2.2. Kết quả ....................................................................................................................37
3.2.3. Định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ..............37

4.3. Vật liệu tiến hành thí nghiệm......................................................................................49
4.3.1. Các dụng cụ và hóa chất tiến hành thí nghiệm ......................................................49
4.3.2. Các môi trường sử dụng...........................................................................................50
4.4. Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................................50
4.5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................50
4.5.1. Quy trình phân tích ..................................................................................................51
4.5.2. Thuyết minh quy trình .............................................................................................51
4.5.2.1. Phương pháp tăng sinh vi khuẩn..........................................................................51
4.5.2.2. Phương pháp phân lập mẫu..................................................................................52
4.5.2.3. Phương pháp cấy chuyển khuẩn lạc đặc trưng...................................................52
4.5.2.4. Phương pháp thực hiện đông tụ huyết tương .....................................................52
4.5.2.5. Phương pháp tính toán kết quả ............................................................................52

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

iv

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây
nhiễm trên thực phẩm
4.6. Kết quả ..........................................................................................................................53
4.6.1. Kết quả cảm quan .....................................................................................................53
4.6.2. Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Staphylococcus aureus.......................................54
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................56
5.1. Kết luận.........................................................................................................................56
5.2. Kiến nghị.......................................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Sak: Staphylokinase
CP: Capsular polysaccharide
ET: Exfoliatin toxin
ETA: Exfoliatin toxin A
ETB: Exfoliatin toxin B
TSST-1: Toxic shock syndrome toxin-1
TNF: Tumor necrosis factor
TNF-Tumor necrosis factor alpha
LPS: Lypopolysaccharide

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

vi

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây
nhiễm trên thực phẩm
TLR-4: Toll like receptors-4
PAF: Platelet activating factor
SE: Staphylococcal enterotoxins
SEA: Staphylococcal enterotoxins A
SEB: Staphylococcal enterotoxins B
SEC: Staphylococcal enterotoxins C
SED: Staphylococcal enterotoxins D
SEE: Staphylococcal enterotoxins E
SER: Staphylococcal enterotoxins R
SEG: Staphylococcal enterotoxins G
SEU: Staphylococcal enterotoxins U

Hình 2.5: Cấu trúc phân tử của aflatoxin M1 .................................................................................................... 10
Hình 2.6: Cấu trúc phân tử của aflatoxin M2 .................................................................................................... 11
Hình 2.7: Cấu trúc phân tử của ochratoxin A, B và C....................................................13
Hình 2.8: Cấu trúc các độc tố của fumonisin B1, B2, B3 .............................................15,16
Hình 2.9: Cấu trúc phân tử của patulin............................................................................18
Hình 2.10: Hình thái đặc trưng của Staphylococcus aureus ...........................................21
Hình 2.11: Hoạt tính siêu kháng nguyên SE ....................................................................33
Hình 3.1: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP.................................38
Hình 3.2: Kết quả thử nghiệm coagulase..........................................................................39
Hình 3.3: Gel agarose phân tích M-PCR với cặp mồi femA ở các nồng độ khác nhau43
Hình 3.4: Gel agarose phân tích M-PCR gradient nồng độ MgCl2 và nhiệt độ lai trên
chủng S. aureus ATCC 43300 (MRSA).............................................................................43
Hình 3.5: PCR kiểm tra độ pha loãng chứng nội tại .......................................................44
Hình 3.6: Bộ kít M-PCR phát hiện MRSA.......................................................................44
Hình 3.7: Một số bộ kít ELISA ..........................................................................................46
Hình 3.8: Bộ kít RPLA .......................................................................................................47
Hình 4.1: Sơ đồ nội dung bố trí thí nghiệm ..................................................................... 50
Hình 4.2: Quy trình phân tích Staphylococcus aureus thực nghiệm..............................51
Hình 4.3: Cảm quan thịt gà................................................................................................53
Hình 4.4: Sơ đồ tỷ lệ nhiễm S.aureus trên các mẫu thực nghiệm...................................54

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

viii

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây
nhiễm trên thực phẩm

“Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lậy nhiễm
trên thực phẩm”.
Nội dung bài khóa luận này sẽ đáp ứng cho ta một cái nhìn tổng quan về một
số độc tố vi sinh vật gây bệnh trên thực phẩm, phương pháp xác định và các biện
pháp phòng chống lây nhiễm vi sinh vật trên thực phẩm.
1.2. Mục đích
Nghiên cứu về những độc tố vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và đi sâu
tìm hiểu, tổng quan về một số loài thường xuyên gây nhiễm trong thực phẩm như:
Clostridium botulinum và độc tố botulin, nấm mốc và các độc tố thường gặp của nấm
mốc.
Quan trong nhất là tìm hiểu tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất
một số biện pháp phòng ngừa lây nhiễm vi sinh vật này trên thực phẩm.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái, cấu tạo, di truyền, hoạt động sinh lí,
hóa học… của 1 số nhóm vi sinh vật.
Nghiên cứu các cơ chế gây độc, độc tính và của 1 số nhóm vi sinh vật gây
bệnh cho người và động vật.
GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

1

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm
Nghiên cứu về các phương pháp phát hiện và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm.

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

2 chuỗi nhẹ gồm 1 đầu chứa carboxyl (mảnh A) có trọng lượng phân tử là 50000
dalton và nặng gồm 1 đầu chứa amino (mảnh B) có trọng lượng phân tử là 100000
dalton được nối với nhau bằng cầu nối disulfur có gắn với 1 phân tử Zn.
Các đoạn ở điểm cắt A của độc tố trên một trọng lượng phân tử cơ bản trở
thành độc tố mạnh nhất trong tự nhiên.

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

3

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm

Hình 2.1: Cấu trúc của độc tố botulin
b. Cơ chế độc tố botulin
Tính gây bệnh của Clostridium botulinum phụ thuộc hoàn toàn vào việc sản
xuất độc tố thần kinh. Các độc tố hoạt động trên dây thần kinh ngoại vi tiết ra
acetylcholine để ngăn chặn sự phóng thích acetylcholine ở đoạn giao thần kinh cơ.
Điều này ngăn cản cơ hoạt động bình thường và là nguyên nhân gây ra bệnh bại liệt.
Hoạt động của độc tố khởi đầu bởi những cách sau:
-

Nhiễm độc sơ cấp: đây là kết quả của việc tiêu thụ các loại thực phẩm trong

đó bị nhiễm các bào tử sản xuất ra các độc tố.
-


là 1 endoprotease chúng liên kết với các thụ thể N-ethylmaleimide nhạy cảm với các
yếu tố thủy phân protein. Những protein này giải phóng các chất truyền thần kinh
đặc biệt là acetylcholine.
Enzyme thủy phân các protein độc tố ngăn cản sự hợp thành các túi tiết
acetylcholine trên bề mặt bên trong của màng tế bào với các màng nơron trước khớp
thần kinh (sinap). Điều này dẫn đến việc ức chế để giải phóng acetylcholine tại
những khớp thần kinh tiết acetylcholine ngoại vi, đó cũng chính là mục đích hoạt
động của độc tố botulin. Đầu tiên các dây thần kinh của não bị ảnh hưởng gây tê liệt
sau đó đến các dây thần kinh vận động và các cơ bắp.
2.1.2. Độc tố nấm mốc
2.1.2.1. Giới thiệu chung về nấm mốc
a. Hình thái
Nấm mốc là vi sinh vật không có diệp lục tố nên không có khả năng tự tổng
hợp các chất dinh dưỡng cho chính bản thân. Do đó, chúng chỉ phát triển trên nguồn
dinh dưỡng có sẵn.
Nấm mốc là loài vi sinh vật phát triển thành hình sợi phân nhánh. Những sợi
phân nhánh này phát triển thành từng đám, người ta gọi là khuẩn ty. Khuẩn ty khi
phát triển trên môi trường đặc thường phân ra 2 loại: khuẩn ty ký sinh và khuẩn ty
dinh dưỡng.

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

5

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm
Hai loại khuẩn ty này đóng vai trò và nhiệm vụ khác nhau, khuẩn ty dinh

6

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm

Hình 2.3: Penicillium chrysogenum
c. Hình thức sinh sản
+, Sinh sản sinh dưỡng
Nấm mốc có thể sinh sản phát triển bằng khuẩn ty, trong lòng khuẩn ty có sự
xuất hiện của một hay nhiều tế bào hình cầu, có màng dầy bao bọc, bên trong có
nhiều chất dự trữ. Gặp điều kiện thuận lợi thì các tế bào hình cầu này sẽ phát triển
thành một sợi nấm mới.
Nấm mốc còn có thể sinh sản bằng hạch nấm, đây là 1 khối hình tròn đều, bên
trong là một tổ chức sợi xốp và thường có màu trắng. khi gặp điều kiện thuận lợi
chúng sẽ phát triển bình thường.
+, Sinh sản vô tính
Đây là kiểu sinh sản chủ yếu bằng bào tử, các bào tử có thể được tạo thành từ
những phương pháp sau:
-

Bào tử được tạo thành do sự cắt đoạn của các sợi nấm

-

Bào tử có thể được tạo thành từ tế bào sinh bào tử bằng cách nảy chồi

-

nhân tổng hợp mycotoxin hoặc theo bệnh lý do mycotoxin gây nên
Những mycotoxin thường gặp trong chuỗi thực phẩm là:
-

Aflatoxin B1, B2, G1 và G2

-

Ochratoxin A

-

Fumonisin B1, B2 và B3

-

Patulin

2.1.2.3. Aflatoxin
Có thể tìm thấy aflatoxin trong các loại thực phẩm khác nhau như: ngô, gạo,
bánh mì và các loại hat chứa dầu.
Aflatoxin là một sản phẩm trao đổi thứ cấp bậc hai trong quá trình phát triển
của vi nấm, nó không phải là chất dự trữ và cũng không phải là chất cặn bã.
a. Nguồn gốc
Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc Aspergillus flavus,
A.parasiticus, A.nomius. Loài Penicillium puberulum có thể sản sinh ra các aflatoxin
nhưng với số lượng ít.

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành


khử. Công thức của aflatoxin B2 là C17H14O6, còn công thức của aflatoxin G2 là
C17H14O7

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

9

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của aflatoxin B1, B2, G1 và G2
Năm 1963 trong nghiên cứu chất độc ở sữa và thịt bò đã ăn phải thực phẩm có
aflatoxin. Alicroft và Carnaghan đã nhận thấy trong 2 loại thực phẩm này có dẫn
xuất của aflatoxin B1 và B2. Độc tố này được gọi là “độc tố sữa”, là các chất
hydroxyl hóa của aflatoxin B1 và B2 tại vị trí 9a lần lượt được gọi là aflatoxin M1 và
M2. Công thức nguyên của aflatoxin M1 là: C17H12O7, công thức nguyên của
aflatoxin M2 là: C17H14O7.

Hình 2.5: Cấu trúc phân tử của aflatoxin M1

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

10

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng



-

Giảm tổng hợp protein.

d. Độc tính của aflatoxin
Độc tính của aflatoxin có hai loại đó là độc tính cấp và độc tính mãn
-

Độc tính cấp là sự ngộ độc cấp tính thể hiện bằng cái chết của các động vật thí

nghiệm trong những khoảng thời gian thay đổi tùy theo khả năng chịu đựng của từng
loài. Giải phẫu bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận
cấp, tụ máu ở phổi. gan dần mất màu còn thể tích thì tăng lên. Khi không có nối đôi

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

11

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm
ở vòng furan đầu thì độc tính giảm đi 4,5 lần. Như vậy B1 độc hơn B2 và G1 độc hơn
G2. Và độc tính cũng giảm khi có hai vòng lacto (G1 và G2) do đó aflatoxin loại B
độc hơn loại G. Độc tính của aflatoxin rất cao và làm tổn thương đến tế bào.
-

Độc tính mãn là những triệu chứng do nhiễm độc mãn tính. Biểu hiện đầu



Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm

Hình 2.7: Cấu trúc phân tử của ochratoxin A, B và C
c. Cơ chế gây độc của ochratoxin
Ochratoxin gây ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tRNA) và các axit
amin. Ochratoxin còn ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine-tRNA ở gan.
Sự ức chế cạnh tranh phenylalanine làm đảo lộn các axit amin còn dư, các
phenylalanine dư cũng tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ
thể.
Sự ức chế miễn dịch của ochratoxin được biểu hiện làm giảm thực bào và ức
chế tế bào lympho.
Hợp chất tương tự của OTA trong đó các phenylalalanine được thay thế bởi
các axit amin khác có tác dụng ức chế tương tự như trên các amino axit synlaza
tRNA tương ứng cụ thể. 4P-hydroxyochratoxin A, 1 chất chuyển hóa của OTA cũng
có những hoạt dộng tương tự trong khi -ochratoxin và OTB không có những hoạt
động này.
Ochratoxin có thể hoạt động trên các enzyme khác như 1 chất nền
phenylalanine. OTA gây ức chế hydroxylase phenylalanine, 1 nửa phenylalanine của
OTA là 1 phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh các tế bào gan trong cơ thể.
GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

13

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm

350C F. moniliforme phát triển mạnh nhất trên môi trường nuôi cấy phòng thí
GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

14

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng


Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa
lây nhiễm trên thực phẩm
nghiệm và trên lương thực, tuy nhiên lượng fumonisin được tổng hợp là không
nhiều. Trong điều kiện yếm khí, nấm mốc phát triển rất yếu và không có khả năng
sinh độc tố.
b. Cấu trúc phân tử của fumonisin
Fumonisin là nhóm hợp chất dieste của acid tricacboxylic với các rượu bậc
cao khác nhau, fumonisin chứa nhóm amin bậc nhất, tan trong nước và bền vững với
nhiệt độ. Trong số các fumonisin, chỉ số fumonisin B1, B2 và B3 được phát hiện với
một hàm lượng đáng kể trong tự nhiên.
F. moniliforme không chỉ tổng hợp fumonisin B1 mà còn tổng hợp các dẫn
xuất khác của độc tố này. Các dẫn xuất này chỉ khác nhau ở nhóm hydroxyl đính với
nguyên tử carbon ở vị trí thứ 10 của mạch chính fumonisin B. Trong đó, các dẫn xuất
B1, B2 và B3 của fumonisin là các độc tố phổ biến nhất trong tự nhiên.

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành

15

SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng




SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng