BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID
TRONG CÂY THUỐC THƯỢNG
(Phaeanthus vietnamensis Ban)

Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS. TRẦN CÔNG LUẬN
Họ và tên sinh viên: VÕ DUY LÊ SƠN
Ngành: Công nghệ Hóa học
Niên khóa: 2008-2012

Tháng 8/2012


ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID
TRONG CÂY THUỐC THƯỢNG
(Phaeanthus vietnamensis Ban)

Tác giả

VÕ DUY LÊ SƠN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ Hóa học

Giảng viên hướng dẫn:


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Định tính – định lượng – chiết tách và khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn của hợp chất alkaloid trong cây Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamensis
Ban)” được tiến hành tại trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, thời
gian từ tháng 01/2012 đến tháng 8/2012.
Giảng viên hướng dẫn:
PGS-TS. TRẦN CÔNG LUẬN
Ngày nay, chúng ta không thể phủ nhận được tầm quan trọng của việc điều trị
bằng dược phẩm tây y nhưng bên cạnh hiệu quả điều trị, các dược phẩm này thường để
lại tác dụng phụ. Vì thế, xu hướng hiện nay trên thế giới là quay lại nghiên cứu nguồn
thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật.
Cây Thuốc thượng được phát hiện ở núi Bà Nà – Đà Nẵng thường được người
dân dùng để trị các bệnh lý nhiễm trùng nhưng chưa được nghiên cứu rộng rãi. Để bảo
tồn và phát triển dược liệu này thì việc định danh và nghiên cứu một cách khoa học và
có hệ thống là một trong những công tác cần thiết.
Đề tài đã áp dụng các phương pháp hóa học, kĩ thuật sắc kí lớp mỏng, kĩ thuật
chiết tách lỏng – lỏng và lỏng – rắn để định tính – định lượng – chiết tách hợp chất
alkaloid trong cây Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamsis Ban). Hoạt tính kháng khuẩn
của hợp chất alkaloid được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Những kết quả đã đạt được như sau:
- Định tính bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng đều cho thấy cây Thuốc
thượng có hợp chất chính là alkaloid.
- Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân cho thấy hàm lượng alkaloid tổng
trong mẫu nghiên cứu là 3,925%.
- Hoạt tính kháng khuẩn của cao alkaloid tổng trên các chủng Gram dương và
Gram âm mạnh hơn cao nước và cao n-butanol.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii
TÓM TẮT .................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... xi
Chương 1 ........................................................................................................................1
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
1.2.Mục đích và phạm vi đề tài ...................................................................................1
1.3.Ý nghĩa của đề tài ..................................................................................................1
Chương 2 ........................................................................................................................2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................................2
2.1.Tổng quan về cây Thuốc thượng (Hội đồng dược điển Việt Nam, 2002) ............2
2.2.Tổng quan về alkaloid ...........................................................................................3
2.2.1.Khái niệm về alkaloid .....................................................................................3
2.2.2.Phân bố alkaloid trong thiên nhiên .................................................................4
2.2.3.Danh pháp .......................................................................................................5
2.2.4.Tính chất chung của alkaloid ..........................................................................6
2.2.4.1.Lý tính .....................................................................................................6
2.2.4.2.Hóa tính ...................................................................................................7
2.2.5.Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid .......................................................9
2.2.5.1.Chiết xuất.................................................................................................9
v


2.2.5.2.Tinh chế và phân lập (Nguyễn Kim Phi Phụng. 2007. Phương pháp cô
lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM) ..................................11

3.4.1.2. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng ...........................................................26
3.4.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân (Phương pháp nghiên cứu dược
liệu. Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Y Dược Tp.HCM, 2007) ......................26
3.4.2.1.Xác định độ mất khối lượng do làm khô ...............................................26
3.4.2.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân .........................................27
3.4.3.Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc alkaloid (Nguyễn Kim Phi Phụng.
Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2007) .28
3.4.3.1.Chiết xuất alkaloid (theo bài giảng dược liệu, Bộ môn Dược Liệu,
trường đại học dược Hà Nội, 2002; Trần Hùng, 2006) .....................................28
3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cây Thuốc thượng và hợp chất alkaloid
trên một số chủng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch ............28
Chương 4 ......................................................................................................................29
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................................29
4.1.Kết quả.................................................................................................................30
4.1.1.Định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học...................................................30
4.1.2.Định tính alkaloid bằng SKLM ....................................................................30
4.1.3.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân ................................................31
4.1.3.1. Độ ẩm nguyên liệu................................................................................31
4.1.3.2. Hàm lượng alkaloid toàn phần có trong dược liệu ...............................31
4.1.4.Chiết xuất, phân lập alkaloid ........................................................................31
4.1.4.1.Phân lập alkaloid bằng SKC pha thuận .................................................32
4.1.5. Kết quả xác định khả năng tạo thành vòng kháng khuẩn trên một số cao
chiết bằng phương pháp đục lỗ..............................................................................35
4.2.Thảo luận .............................................................................................................38
vii


4.2.1.Định tính alkaloid .........................................................................................38
4.2.2.Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân ................................................38
4.2.2.1.Độ ẩm nguyên liệu.................................................................................38


HPLC

High Performance Liquid Chromatography

HSQC

Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

H2SO4

Acid Sulfuric

Me

Methyl (-CH3)

MeOH

Methanol

Na2SO4

Natri Sulfate

NH4OH

Amoniac

NMR


UV

Ultra Violet

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Độ kiềm của các alkaloid .............................................................................. 9
Bảng 4.1: Độ ẩm của nguyên liệu ................................................................................ 31
Bảng 4.2: Hàm lượng alkaloid toàn phần .................................................................... 32
Bảng 4.3: Các phân đoạn cột sắc kí I ........................................................................... 34
Bảng 4.4: Các phân đoạn cột sắc kí II .......................................................................... 35
Bảng 4.5: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao tổng ..................................... 36
Bảng 4.6: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao alkaloid ............................... 36
Bảng 4.7: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao chloroform .......................... 36
Bảng 4.8: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao n-butanol ............................. 37
Bảng 4.9: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn của cao nước .................................... 37
Bảng 4.10: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của các cao kháng khuẩn37

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Mẫu dược liệu ban đầu .................................................................................. 3
Hình 3.1: Quy trình phản ứng định tính alkaloid bằng phản ứng hóa học và SKLM . 25
Hình 4.1: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ................................................... 30


Nguyên liệu và dược liệu còn khá mới, làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu
hơn về hóa và hoạt tính sinh học.

1


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Tổng quan về cây Thuốc thượng (Hội đồng dược điển Việt Nam, 2002)

Đối tượng nghiên cứu là cây Thuốc thượng ở núi Bà Nà – Đà Nẵng, theo tìm
hiểu thì cây Thuốc thượng được sử dụng để trị thương trong thời kỳ chiến tranh và
hiện nay chưa được nghiên cứu.
Tên thông dụng: Thuốc thượng, thuốc Mọi, Da xà lắc, thuốc dấu cà doong.
Tên khoa học: Phaeanthus vietnamensis Ban.
Thuộc:
- Giới: Thực vật
- Ngành: Magnoliophyta
- Lớp: Magnoliopsida
- Bộ: Magnoliales
- Họ: Annonaceae (Na)
- Chi: Phaeanthus
Mô tả: Cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao 2-10m. Cành non gần như không lông. Lá
thuôn hoặc gần hình mác, dài 9-16cm, rộng 3-6,5cm, đầu có mũi dài và mọn, gốc hình
nêm hơi lệch, không lông; gân bên 9-11 đôi; cuống dài 5-6mm; hoa mọc so le với lá,
thường thành xim 2 hoa. Hoa có cuống dài 1,5-3cm, mang 4-6 lá bắc nhỏ; lá đài và
cánh hoa ngoài rất giống nhau, dài trên 1mm; nhị nhiều, lá xoăn nhiều. Thân quả hình
trái xoan, cỡ 12-15 x 6-7mm, không có lông, khi chín màu vàng sau chuyển thành màu
mận chín; cuống dài 13-15mm, vỏ quả rất mỏng.



vật”.
Sau này, các nhà khoa học đã chiết được nhiều hợp chất có tính kiềm từ thực vật:
[Piperin (1819), cafein (1819), colchicin (1820), coniin (1826), codein (1832), narcein
(1832), papaverin (1848), …] đồng thời cũng tìm thấy trong động vật như:
Samandarin, samannin lấy từ tuyến da của loài Salamandra maculosa và Salamandra
altra; bufotenin, bufotenidin, erotonin là những chất độc lấy từ loài cóc Bufo;
batrachotoxin có trong tuyến da loài ếch độc vùng Trung Mỹ Phyllosbates aurotaenia.
Ngoài tính kiềm, alkaloid còn có một số đặc tính khác như hoạt tính sinh học
mạnh và phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. Sau này,
Polonopski đã đưa ra định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa
số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong
động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ứng hóa học với một số
thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid” (Theo Bài giảng dược liệu, Bộ môn
Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, 2002; Thực tập hợp chất tự nhiên, Bộ môn
Sinh hóa, trường Đại học KHTN, 2005; Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Viện Dược
Liệu, 2005).
2.2.2.Phân bố alkaloid trong thiên nhiên

Alkaloid có phổ biến trong thực vật. Ngày nay đã biết trên khoảng 16000
alkaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết ở thực vật bậc cao chiếm khoảng 15-20% tổng số
các loài cây. Có những họ có trên 50% loài cây chứa alkaloid như Ranunculaceae,
Berberidaceae, Papaveraceae, Buxaceae, Cactaceae.
Ở nấm, alkaloid có trong nấm Cựa khỏa mạch Claviceps purpurea, nấm Amanita
phalloides.
Ở động vật cũng đã tìm thấy alkaloid ngày càng tăng: Samandarin, samandaridin,
samanin có trong tuyến da của loài kì nhông Salamandra maculosa và Salamandra
altra; bufotenin, bufotenidin, dehydrobufotenin lấy từ nhựa cóc Bufo bufo gagorizans,
Bufobufo asiaticus, Bufo melansiticus; batrachotoxin có trong tuyến da loài ếch độc

trường hợp alkaloid kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalkaloid như solasonin và
solamacgin trong cây Cà lá xẻ Solanum laciniatum (Theo Bài giảng dược liệu, Bộ môn
Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, 2002).
2.2.3.Danh pháp

Các alkaloid trong dược liệu thường có cấu tạo phức tạp nên người ta không gọi
tên theo danh pháp hoá học mà thường gọi chúng theo một tên riêng. Tên của các
alkaloid luôn có đuôi in và xuất phát từ:
- Tên chi hoặc tên loài của cây + in
5


Ví dụ:
Papaverin từ Papaver somniferin
Strychninin từ Strychnos nux – vomica
Ephedrin

từ Ephedra sinica

Palmatin

từ Jatrorrhiza palmata

Cocain

từ Erythroxylum coca

- Đôi khi dựa vào tác dụng của alkaloid đó:
Ví dụ: Emetin do từ emetos có nghĩa là gây nôn, morphin do từ morpheus là gây
ngủ.

Mùi vị: đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như
capsaicin, piperin, chavicin, …
Màu sắc: hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một vài alkaloid có màu vàng
như berberin, palmatin, chelidonin.
Độ tan:
- Nói chung các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước mà thường tan
tốt trong dung môi hữu cơ như ether, chloroform, benzen, methanol, … Trái lại, các
alkaloid ở dạng muối thường dễ tan trong nước và hầu như không tan trong các dung
môi hữu cơ ít phân cực.
- Có một số trường hợp ngoại lệ, alkaloid dạng base lại tan tốt trong nước như
coniin, nicotin, spartein, colchicin, cafein (cafein tan 1/80 trong nước lạnh và ½ trong
nước sôi), alkaloid dạng muối lại ít tan trong nước như berberin nitrat, … Một số
alkaloid có chức phenol như morphin, cephelin tan trong dung dịch kiềm.
- Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid dạng base và dạng muối người ta sử dụng
dung môi thích hợp để chiết xuất, phân lập và tinh chế alkaloid.
2.2.4.2.Hóa tính

Alkaloid nói chung có tính kiềm yếu là do trong phân tử có nitơ. Người ta có thể
tính được độ kiềm của các chất. Người ta xếp:
- Alkaloid có độ kiềm mạnh thì giá trị pKB < 3.
- Alkaloid có độ kiềm trung bình thì pKB: 3-7 (alkaloid trong họ Cà, alkaloid trong
thuốc phiện, …).
- Alkaloid có độ kiềm yếu thì pKB: 7-10 (alkaloid trong vỏ Canhkina).
- Alkaloid có độ kiềm rất yếu thì pKB: 10-12 (alkaloid có nhân purin).
- Ngoại lệ: có alkaloid không còn tính kiềm như: ricinin, colchicin, theobromin.
Tác dụng với acid, alkaloid tạo ra các muối tương ứng.
7


Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pb, …) tạo ra các muối phức.

8


Độ kiềm

Độ kiềm

pkB

pkB
Quinolin

Piperidin

N

9,2

2,8

H

N-methyl
piperidin

N

3,9

Isoquinolin

N

Codein

6,1

Coniin

3,1
N
H

Narcotin

7,8

Papaverin

8,1

Viện Dược Liệu(2005)

2.2.5.Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid
2.2.5.1.Chiết xuất

Việc chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung sau:
- Alkaloid nói chung là những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối
của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tannin. Nên phải tán nhỏ dược
liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những
kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh.

hữu cơ. Trong phòng thí nghiệm người ta lắc trong bình gạn, trong công nghiệp phải
có thiết bị thích hợp.
Gộp các dịch chiết muối alkaloid lại rồi kiềm hoá để chuyển alkaloid sang
dạng base, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid base. Việc
10


chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hoặc các dụng cụ chiết chất lỏng
theo kiểu bình ngấm kiệt.
Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid base, người ta thường
loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi
hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu cắn alkaloid thô.
 Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước (Phương pháp Stas
- Otto)
Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất.
Chiết bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dược liệu sẽ
chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên.
Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửa
dịch chiết đậm đặc còn lại. Ở môi trường acid, ether thường hòa tan một số tạp chất
chứ không hòa tan các alkaloid.
Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nước rồi lấy alkaloid base được
giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, (dung môi này phải không trộn lẫn
với nước), thường dùng CHCl3, ether, benzene, …Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc
hơi tới khô sẽ thu được cặn alkaloid thô.
 Chiết bằng cồn
Có một số alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở
môi trường trung tính do đó sau khi tán nhỏ dược liệu ở kích thước thích hợp đem
thấm ẩm và chiết bằng cồn ethylic cho tới kiệt alkaloid. Quá trình tiếp theo được thực
hiện tương tự như trên.
Trong quá trình chiết xuất người ta dùng thuốc thử tạo tủa để kiểm tra xem các

 Nếu sử dụng cationit
Cat -.H+ + [BH]+.Cl - ↔ Cat -.[BH]+ + H+ + Cl - .
Nhựa cationit hấp phụ alkaloid tạo ra dạng muối alkaloid, alkaloid này sẽ được
đẩy ra khi có dung dịch kiềm hoặc amoniac, theo phương trình sau:
Cat -.[BH]+ + [NH4]+.OH- ↔ Cat -.[NH4]+ + B + H2O.
Alkaloid base không hòa tan trong nước được giữ lại trong cột và sau đó được
chiết ra bằng dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp.
 Nếu sử dụng anionit
Ani+.OH - + [BH]+.Cl - ↔ Ani+.Cl - + B + H2O.
Khi cho dung dịch muối alkaloid qua cột anionit ở dạng OH -, gốc acid được
trao đổi với OH -, alkaloid được giải phóng dạng base và sau đó được chiết ra bằng
dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp.
12


Các alkaloid trong hỗn hợp thường có độ kiềm khác nhau, do đó khi cho qua
cột trao đổi ion có sự hấp phụ khác nhau và trong lớp ionit xảy ra sự trao đổi kép nối
tiếp nhau, chất có độ kiềm lớn bị giữ lại ở trên và chất có độ kiềm nhỏ chuyển sâu vào
cột ionit do đó người ta có thể lấy tách riêng các alkaloid ra.
Ngoài ra, trong một số trường hợp người ta dùng các ionit lưỡng tính chứa các
nhóm acid lẫn base.
- Phương pháp sắc kí cột
Dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp alkaloid có độ hấp phụ khác
nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột. Chất hấp phụ thường dùng là oxyt nhôm,
silicagel dùng cho sắc kí cột, bột cellulose, …Khi cho dịch chiết alkaloid qua cột, các
alkaloid sẽ phân bố lần lượt trong cột, ở phần trên của cột sẽ tập trung chất bị hấp phụ
mạnh nhất, còn ở phần dưới của cột tập trung chất bị hấp phụ kém nhất. Tuy nhiên các
miền chưa được phân thành ranh giới rõ rệt, nghĩa là chưa phân chia rõ rệt các chất
trong cột. Do đó để tách hoàn toàn các alkaloid trong cột người ta phải dùng một dung
môi hay một hệ dung môi chạy qua cột để rửa giải các alkaloid đã hấp phụ trong cột.