ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------

ĐỖ THẾ HOÀNH

XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH
ĐƠN NUCLEOTID RS3738423 (C>T) VÀ RS12401708
(C>T) CỦA GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU
SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG
THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÁNG CORTICOID

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

ĐỖ THẾ HOÀNH

XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH
ĐƠN NUCLEOTID RS3738423 (C>T) VÀ RS12401708
(C>T) CỦA GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU
SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG
THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÁNG CORTICOID
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:


Khoa Xét nghiệm tổng hợp, ThS.BS. Cao Vũ Thư, anh Bùi Quang Long, cô
Nguyễn Ngọc Diệp cùng các anh chị đồng nghiệp Khoa Xét nghiệm tổng hợp BV
Mắt TW đã thật sự động viên và giúp đỡ rất nhiều để tôi hoàn thành luận văn.
Xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ, người thân, vợ và 2 con nhỏ của tôi cùng
các bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ tinh thần và tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới những bệnh nhi và gia đình của họ
đã tham gia vào nghiên cứu này. Sự đóng góp của họ đã giúp tôi hoàn thành luận
văn này.
Hà nội, ngày

tháng

năm 2017

Học viên

Đỗ Thế Hoành


LỜI CAM ĐOAN
Tên tôi là Đỗ Thế Hoành, cao học khóa 24, trường Đại học Khoa học tự nhiên
Hà Nội, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan:
1. Đây là Luận văn do bản thân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Vũ
Thị Thơm và TS. Nguyễn Văn Sáng.
2. Nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào đã được công bố
tại Việt Nam.
3. Các số liệu, thông tin và kết quả trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung
thực, đã được xác nhận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Hà nội, ngày

1.4.2. Phương pháp xác định trình tự Sanger-Coulson ........................................... 19
1.4.3. Giải trình tự bằng máy tự động ..................................................................... 19
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH DI TRUYỂN
GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA ................................................. 20
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................ 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 21
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 22


2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 22
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 22
2.2.2. Các chỉ số nghiên cứu ................................................................................... 22
2.2.3. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................ 22
2.2.4. Các bước tiến hành nghiên cứu .................................................................... 25
2.2.5. Xử lý số liệu .................................................................................................. 29
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................................ 30
3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................ 30
3.2. MỘT SỐ KẾT QUẢ SINH HÓA MÁU VÀ NƯỚC TIỂU ............................... 33
3.3. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA ......................................................................... 36
3.3.1. Kết quả đo độ hấp thụ quang (OD) ............................................................... 37
3.3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số ......................................................... 38
3.4. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI EXON 2 VÀ EXON 4 CỦA GEN NPHS2 ............. 38
3.4.1. Kết quả khuếch đại exon 2 ............................................................................ 38
3.4.2. Kết quả khuếch đại exon 4 ............................................................................ 39
3.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN ..................................................................... 40
3.5.1. Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen hai đa hình đơn rs3738423 ................................ 40
3.5.2. Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen đa hình rs12401708 ........................................... 42
3.6. MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 VÀ RS12401708
VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HCTHTP


dNTP

Deoxynucleotide triphosphat

DNA

Deoxyribonucleotide acid

DDW

Deionized Distilled Water

EDTA

Ethylene diamin tetraacetic acid

HCTH

Hội chứng thận hư

HCTHTP

Hội chứng thận hư tiên phát

HCTHTPTE

Hội chứng thận hư tiên phát trẻ em

NCC


rs

Reference single nucleotide polymorphism

SNP

Single nucleotide polymorphism

SE

Standard error of mean

TAE

Tris acetate ethylene diamin tetraacetic acid


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Mồi exon 2 và exon 4 của gen NPHS2 .....................................................28
Bảng 2.2. Nồng độ các thành phần phản ứng PCR ...................................................28
Bảng 3.1. Phân bố tuổi và giới tính của 2 nhóm đối tượng nghiên cứu....................31
Bảng 3.2. Tuổi khởi phát và số lần tái phát trong 6 tháng của bệnh .........................31
Bảng 3.3. Mức độ tái phát của bệnh..........................................................................32
Bảng 3.4. Kết quả phân tích protein, albumin, creatinin và ure máu, protein niệu và
tỷ lệ protein/creatinin niệu ........................................................................................34
Bảng 3.5. Một số kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch sản phẩm tách DNA.............37
Bảng 3.6. Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen của rs3738423 ................................................41
Bảng 3.7. Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen của rs12401708 ..............................................42
Bảng 3.8. Nồng độ protein, albumin, creatinin và ure máu ở các kiểu gen của


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. Sinh lý bệnh HCTH ......................................................................................7
Sơ đồ 2. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................25


MỞ ĐẦU
Hội chứng thận hư tiên phát trẻ em (HCTHTPTE) là một hội chứng lâm sàng
và sinh hóa xuất hiện khi có tồn thương cầu thận do nhiều nguyên nhân khác nhau,
thường không rõ ràng được đặc trưng bởi: protein niệu tăng cao, protein máu giảm,
albumin máu giảm, lipit và cholesterol máu tăng. Bệnh thường gặp nhất ở trẻ em,
90% trường hợp xảy ra ở độ tuổi dưới 16 với tỷ lệ trẻ nam mắc nhiều hơn trẻ nữ. Tỷ
lệ mắc bệnh thay đổi theo địa dư, tuổi, giới tính và chủng tộc. Khoảng 20% bệnh
nhân không đáp ứng sau điều trị với corticoid (HCTH kháng steroid) và các thuốc
ức chế miễn dịch khác, trong đó 50% bệnh nhân sẽ tiến triển thành suy thận hoặc
các bệnh thận giai đoạn cuối có thể gây tử vong và ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe,
cuộc sống của trẻ.
Ngoài các dấu hiệu lâm sàng và dịch tễ học như: phù nhanh toàn thân, mềm,
ấn lõm và không đau, tiểu ra máu…thì một số chỉ tiêu sinh hóa cận lâm sàng dựa
theo đặc điểm sinh lý bệnh có nghĩa rất quan trọng trong công tác chẩn đoán, theo
dõi và điều trị cho bệnh nhân HCTH. Thận hư là một bệnh mạn tính, diễn biến với
các đợt bộc phát nên bệnh nhân cần phải theo dõi và điều trị lâu dài (ít nhất 5 năm
sau khi bệnh thuyên giảm).
Nhờ tiến bộ của ngành sinh học phân tử người ta có thể nghiên cứu sâu hơn
về cơ chế bệnh học của HCTHTPTE để từ đó đề ra các biện pháp điều trị hiệu quả
hơn đối với từng bệnh nhân. Hiện nay, đã xác định được gen mã hóa cho các protein
có vai trò chính đảm bảo chức năng lọc của cầu thận, trong đó có protein podocin
được mã hóa bởi gen NPHS2. Gen NPHS2 gồm 8 exon, nằm trên vai dài của nhiễm
sắc thể số 1 ở người (1q25-q31). Bằng những bằng chứng thực nghiệm các nhà
khoa học đã chứng minh được đột biến gen NPHS2 có liên quan chặt chẽ đến
T và
rs12401708 C>T của gen NPHS2 với một số chỉ tiêu sinh hóa ở bệnh nhân nhi
mắc hội chứng thận hư tiên phát kháng corticoid" với hai mục tiêu sau:
1. Xác định tần số alen và tỷ lệ đa hình đơn rs3738423 C>T và
rs12401708 C>T ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP
2. Đánh giá mối tương quan giữa hai đa hình trên với một số chỉ tiêu
sinh

hóa

ở

bệnh

nhân

nhi


mỗi năm [51]. Ở Việt Nam hiện chưa có thống kê tỷ lệ mắc mới hàng năm. Tại một
số khoa Nhi hoặc bệnh viện Nhi số trẻ em bị HCTH chiếm khoảng 0,5-1% tổng số
bệnh nhân nhi nội trú và chiếm khoảng 10-30% tổng số trẻ bị bệnh thận [17].
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
1.1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Năm 1827, Bright là người đầu tiên mô tả về lâm sàng và giải phẫu của bệnh
nhân thận, đến đầu thế kỷ XX những bệnh nhân có phù và protein niệu vẫn được
gọi chung là bệnh Bright. Cùng thời điểm đó John Bostock, Robert Christion và
một số nhà khoa học khác đã chứng minh được có nhiều trường hợp có biểu hiện

3


lâm sàng giống bệnh Bright (phù, protein niệu) nhưng khi mổ tử thi lại không thấy
hình ảnh của thận viêm [28, 43]. Vì vậy, đến năm 1905, Friedrich Von Miiller đã
đưa ra thuật ngữ “thận hư” để chỉ các triệu chứng bệnh lý ở thận có tính chất thoái
hóa mà không phải do viêm [25].
Năm 1913, Munk dùng thuật ngữ "thận hư nhiễm mỡ" để chỉ một loại bệnh
thận mà về lâm sàng có phù, protein niệu, giảm protein máu và tăng lipid máu, đồng
thời giải phẫu bệnh có hiện tượng nhiễm mỡ trong các tế bào ống thận trong khi cầu
thận gần như bình thường [25]. Cùng thời điểm đó, Volhard F. và Fahr T. (năm
1914) cho rằng "thận hư" chỉ là một bệnh thoái hóa của ống thận, từ đó thuật ngữ
"thận hư nhiễm mỡ" được dùng để chỉ bệnh thận do nhiễm mỡ ở ống thận [50].
Govaerts (năm 1928) và Bell (năm 1929) cho rằng tổn thương chủ yếu của
bệnh thận hư là ở cầu thận [5, 20]. Năm 1937, Epstein đề xướng giả thuyết "thận hư
nhiễm mỡ" không phải là bệnh ở thận mà là tình trạng rối loạn chuyển hóa lipid.
Quan điểm này được ủng hộ rộng rãi trong một thời gian dài và còn được gọi là
bệnh "Epstein" [18]. Cho đến năm 1950, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật như sinh
thiết thận, kính hiển vi điện tử, miễn dịch huỳnh quang người ta thấy rằng những
tổn thương trong bệnh "thận hư nhiễm mỡ" và bệnh "Epstein" không phải do nhiễm


7


1.1.3.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán
Dựa vào dịch tễ học, các yếu tố thuận lợi và dấu hiệu lâm sàng xuất hiện sớm:
phù nhanh toàn thân (mềm, trắng, ấn lõm, không đau), tiểu ít, rối loạn tiêu hóa, khó
thở, dễ nhiễm khuẩn [7].
Chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO (Kidney Disease Improving
Global Outcomes) năm 2012 gồm: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24h hoặc Protein
niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/l, Protein máu ≤ 56 g/l
[36].
Chẩn đoán HCTHTP kháng steroid theo một trong ba tiêu chuẩn sau [10]:
không thuyên giảm sau 6 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày
mỗi ngày liên tục; không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn
công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều 2
mg/kg/ngày mỗi ngày cách ngày; không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng
prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 3 liều truyền
Methylprednisolon bolus 1000 mg/1,73 m2 cơ thể/48h.
Ở trẻ em sinh thiết thận không cần thiết vì đa số (80-90%) có tổn thương tối
thiểu và đáp ứng tốt với corticoid, nhất là đối với trẻ em dưới 8 tuổi. Chỉ sinh thiết
thận trong một số ít trường hợp như HCTH bẩm sinh, HCTH phối hợp, HCTH
kháng corticoid [7].
1.1.3.4. Theo dõi và điều trị
 Điều

trị triệu trứng

Điều trị phù bằng sử dụng các thuốc lợi tiểu để duy trì lượng nước tiểu hàng
ngày 1,5-2 lít. Điều trị tăng huyết áp nếu bệnh nhân bị cao huyết áp cao, phải dùng

 Phân

nhóm bệnh nhân

Dựa vào đáp ứng sau điều trị với corticoid có thể chia bệnh nhân thành các
nhóm sau:
Nhóm nhạy cảm với corticoid (NCC): hết protein niệu sau khi dùng
prednisolon 8 tuần.
Tái phát không thường xuyên (tái phát thưa): bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn,
hết protein niệu khi dùng prednisolon nhưng tái phát lại dưới 2 lần trong 6 tháng.
Tái phát thường xuyên (tái phát dày): bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn khi dùng
prednisolon nhưng tái phát lại trên 2 lần trong 6 tháng hoặc 6 lần trong 18 tháng.

9


Lệ thuộc steroid: bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn khi dùng steroid, nhưng tái
phát khi giảm liều steroid hoặc ngưng steroid trong vòng 2 tuần.
Nhóm đề kháng với corticoid (NKC): không hết protein niệu sau 8 tuần điều trị
bằng steroid [7].
1.2. MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA TRONG HCTH
1.2.1. Protein toàn phần trong máu và protein nước tiểu 24h
 Protein

toàn phần trong máu

Protein là nhóm chất hữu cơ có hàm lượng nhiều nhất và có vai trò đặc biệt
quan trọng đối với cơ thể. Trong cơ thể, protein được tổng hợp từ 20 loại acid amin,
trong đó có nhiều acid amin cơ thể không tự tổng hợp được mà phải được lấy từ
thức ăn. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin sẽ dẫn đến biến đổi cấu

Albumin có thời gian bán hủy từ 16 đến 26 ngày, gan là cơ quan duy nhất tạo
ra albumin, trung bình mỗi ngày gan tạo ra khoảng 10,5 g. Nồng độ albumin máu
bình thường khoảng 35 - 50 g/l. Albumin máu giảm trong các trường hợp: giảm
cung cấp albumin cho cơ thể (suy dinh dưỡng, suy kiệt, rối loạn tiêu hóa...), giảm
sản xuất albumin (xơ gan, viêm gan mạn...), bệnh thận gây mất albumin qua nước
tiểu (hội chứng thận hư, viêm cầu thận cấp hoặc mạn), đái tháo đường giai đoạn
muộn, ung thư... [2, 16].
Bình thường hầu như không có albumin trong nước tiểu. Khi có tổn thương
thận thì albumin là một trong những protein đầu tiên được phát hiện trong nước
tiểu. Những người có một lượng nhỏ albumin được phát hiện trong nước tiểu có
nguy cơ phát triển suy thận và bệnh tim mạch [2].
1.2.3. Ure máu và nước tiểu
Ure có nguồn gốc chủ yếu từ quá trình thoái hóa protein trong cơ thể và là sản
phẩm quan trọng nhất của chuyển hóa nitơ. Quá trình tổng hợp ure diễn ra ở gan.
Nồng độ ure máu phụ thuộc cùng lúc vào chức năng thận, khẩu phần ăn, quá trình
di hóa protein nội sinh và tình trạng thăng bằng điện giải trong cơ thể. Ure được đào
thải qua thận và một phần qua đường tiêu hóa. Bản thân ure là chất không độc
nhưng sự ứ đọng ure trong huyết tương thường là dấu hiệu của nhiều bệnh lý, đặc
biệt là bệnh thận [2].
•

Nồng độ ure máu bình thường là 3,3 - 8,3 mmol/l; ở trẻ em là 1,8 - 5,4
mmol/l.

•

Nồng độ ure nước tiểu: 250 - 500 mmol/24h

11


tăng huyết áp), suy thận do nguồn gốc sau thận (sỏi thận, ung thư tiền liệt tuyến...).
Giảm trong các trường hợp: loãng máu, có thai, tăng tiết ADH không thích hợp, suy
dinh dưỡng nặng, đái tháo đường, nhiễm trùng, suy tuyến giáp... [2, 48].

12


1.2.5. Một số nghiên cứu về các chỉ số sinh hóa trong bệnh HCTH
Theo nghiên cứu của Om P. Mishra và cộng sự (2014) trên 110 bệnh nhân nhi
mắc HCTH trong đó có 90 bệnh nhân NCC và 20 bệnh nhân NKC cho kết quả nồng
độ protein máu, albumin máu, ure máu và creatinin máu ở 2 nhóm bệnh nhân là
tương đương nhau. Trong đó, nồng độ protein và albumin máu thấp hơn khoảng giá
trị bình thường; nồng độ ure và creatinin máu đều nằm trong khoảng giá trị tham
chiếu [39].
Năm 2016, nghiên cứu của Mohammad H. và cộng sự được thực hiên trên
138 bệnh nhân nhi mắc HCTH tại Iran cho kết quả nồng độ protein máu là 46,1±9
g/l, albumin máu là 23,7 ± 5,5 g/l đều thấp hơn khoảng giá trị bình thường [30].
Theo nghiên cứu của tác giả Vũ Vân Nga (2016) trên 120 bệnh nhi mắc
HCTHTP, chia làm 2 nhóm gồm 58 bệnh nhân NCC và 62 bệnh nhân cho thấy
nồng độ protein máu, albumin máu, protein niệu và tỷ lệ protein/creatinin niệu trước
khi điều trị đều được cải thiện rõ rệt sau khi điều trị 6 tháng [10].
Năm 2017, nghiên cứu của Shatha Hussain Ali và cộng sự trên 54 bệnh nhi
mắc HCTH tại Iraq, được chia làm 2 nhóm 27 bệnh nhân nhạy cảm steroid và 27
bệnh nhân nhạy cảm steroid cho kết quả trung bình nồng độ albumin máu ở 2 nhóm
tương tự nhau. Nồng độ trung bình ure máu và creatinin máu ở nhóm NCC cao hơn
có ý nghĩa so với nhóm NKC (p < 0,05), tuy nhiên vẫn nằm trong khoảng giá trị
bình thường [49].
1.3. ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2
1.3.1. Khái niệm về đa hình đơn nucleotit
Một trong những thành tựu của dự án giải trình tự hệ gen người cho thấy trình


14


giải mã chức năng của các gen trong mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ bệnh
tật, đưa ra các giải pháp thích hợp trong vấn đề phòng bệnh với mỗi cá thể [47].
1.3.2. Protein podocin và gen mã hóa
Quá trình lọc huyết tương để tạo thành nước tiểu xảy ra chủ yếu ở màng cầu
thận. Cầu thận được cấu tạo bởi một mạng lưới mao mạch xếp song song và được
bao quanh bởi bao Bowman. Dịch được lọc từ huyết tương vào trong bao Bowman
gọi là dịch lọc cầu thận. Màng cầu thận được cấu tạo bởi 3 lớp: tế bào nội mô thành
mao mạch, lớp màng đáy và lớp tế bào biểu mô chuyên hóa [29].
Lớp biểu mô chuyên hóa đóng vai trò quan trọng trong điều hòa chức năng lọc
tại cầu thận, gồm các tế bào biểu mô được biệt hóa ở mức độ cao, gọi là podocyte.
Podocyte là tế bào biểu mô có kích thước lớn, hình thể không đều, có nhiều tua bào
tương nằm song song với màng đáy. Từ những tua bào tương này phát sinh nhiều
tua nhỏ thẳng góc tận cùng trên màng đáy với khoảng cách đều nhau tạo ra các khe
hở nhỏ gọi là slit diagram, đường kính khoảng 70-75 Ao. Gần đây người ta đã
chứng minh được rằng có 3 protein quan trọng trong slit diagram điều hòa HCTH
là: Nephrin, CD2AP và Podocin [45].

Hình 1.2. Cấu tạo màng cầu thận
(Nguồn: http://www. researchgate.net/figure/5991022_fig2_Fig-2-Schematic-viewof-the-molecular-anatomy-of-two-podocyte-foot-processes-yellow)
Podocin là một loại protein gắn màng, thuộc họ stomalin có cấu trúc giống
như kẹp tóc, cả hai đầu đều nằm trong tế bào chất. Podocin tồn tại dưới dạng oligo

15


trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở khu vực slit diagram nơi nó tương tác với

Bằng những bằng chứng thực nghiệm trên động vật các nhà khoa học đã
chứng minh được đột biến gen NPHS2 có liên quan tới HCTH [21, 27, 46, 56].
1.3.3. Đa hình đơn rs12401708 C>T và rs3738423 C>T của gen NPHS2

16