ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

TRẦN MAI ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA 2013 - 2018

HÀ NỘI - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
------------

TRẦN MAI ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA 2013 - 2018

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

chromatography)

MS

Khối phổ (Mass Spectrometry)

GC

Sắc ký khí (Gas Chromatography)

DAD

Đầu dò chuỗi diode (Diode Array Detector)

FLD

Đầu dò huỳnh quang (Fluorecence Detector)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

ICH

Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm
sử dụng cho con người (International conference on

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen ........................................................... 3
1.1.1. Cấu trúc, tính chất ........................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng dược lý ............................................................................ 3
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang ..... 4
1.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................................... 4
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang
.....8
1.3. Các phương pháp định lượng flurbiprofen ......................................... 10
1.3.1. Phương pháp chuẩn độ .................................................................. 10
1.3.2. Phương pháp quang phổ phân tử ................................................. 10
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................... 11
1.3.4. Phương pháp sắc ký khí ................................................................ 15
1.4. Thẩm định quy trình phân tích ............................................................. 16
1.4.1. Tính đặc hiệu................................................................................. 17
1.4.2. Độ chính xác ................................................................................. 18
1.4.3. Độ đúng......................................................................................... 19
1.4.4. Tính tuyến tính .............................................................................. 20
1.4.5. Miền giá trị.................................................................................... 20
1.4.6. Giới hạn phát hiện ....................................................................... 21
1.4.7. Giới hạn định lượng ...................................................................... 22
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 23
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị.............................................................. 23


Bảng 1

Tên bảng
Đặc điểm của một số đầu dò

Số trang
11

Bảng 2

Điều kiện chạy nguồn hoá ESI

17

Bảng 3

Chương trình pha động gradient

17

Bảng 4

Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa
lớn nhất của ống quang tử

30

Bảng 5

Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng

Bảng 10

So sánh các thông số thẩm định quy trình định lượng
flurbiprofen của đầu dò DAD và đầu dò FLD

48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Số trang

Hình 1

Công thức cấu tạo của flurbiprofen

3

Hình 2

Sơ đồ hệ thống HPLC

5

Hình 3

Minh hoạ các thông số sắc ký


Sơ bộ khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng
phát xạ tối ưu

37

Hình 9

Khảo sát bước sóng phát xạ cực đại

37

Hình 10

Khảo sát bước sóng kích thích cực đại

38

Hình 11

Sắc ký đồ ở điều kiện tối ưu hóa với đầu dò FLD

38

Hình 12

Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) và độ
trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu của các pic: sản
phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c)


được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn ngừa và
làm giảm co đồng tử trong lúc mổ [18].
Trên thế giới, đặc biệt là tại các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ,
flurbiprofen đang được sử dụng rộng rãi dưới nhiều tên thương mại khác nhau
như Antadys, Amedolfen, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên
các thuốc này chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng
không có chuyên luận về Flurbiprofen. Phát triển các nghiên cứu về
flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có
thêm lựa chọn thuốc trong điều trị, nhất là với một thuốc có giá trị ứng dụng
lâm sàng cao và tác dụng đa dạng như flurbiprofen. Một tính chất đáng chú ý
là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ thuốc dẫn nano có cấu
trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,… đang là hướng nghiên cứu
được quan tâm trên thế giới [10, 18, 25, 35].
Trong quá trình tìm hiểu của chúng tôi, cho đến thời điểm hiện tại, trên
thế giới chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò
huỳnh quang để định lượng flurbiprofen trong dược phẩm tinh khiết và các
dạng bào chế được công bố. Số lượng các nghiên cứu sử dụng phương pháp
HPLC ghép đầu dò huỳnh quang để xác định flurbiprofen trong dịch sinh học

1


là không nhiều. Điều này càng cho thấy tính mới và cần thiết của việc xây
dựng quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ghép đầu dò huỳnh quang.
Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã tiến hành Xây dựng quy trình
định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100mg bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode–array [2]. Mục tiêu của đề tài
này là tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên
nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh

Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và
cảm nhận đau. Flurbiprofen có tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase
3


(COX) không chọn lọc, từ đó ức chế hoạt động của cả hai enzyme COX–1 và
COX–2 – có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2)
và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit arachidonic. Nồng độ prostaglandin giảm
giúp cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt.
Tác dụng dược lý
Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp của
hai đồng phân quang học (+) S và (–) R. Đồng phân (+) S thể hiện hầu hết
trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt tính giảm
đau.
Thuốc được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài đối
với bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính
khớp, đau thắt lưng, viêm gan cấp tính [10]. Thuốc cũng có thể được sử dụng
để giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình
đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13].
Bên cạnh chống viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen còn cho thấy tác dụng ức
chế kết tập tiểu cầu rất mạnh. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy việc sử
dụng lâu dài flurbiprofen làm giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và trì hoãn
sự xuất hiện của nó [17, 23, 25, 32]. Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật
nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ [18].
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh
quang
1.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển
của pha động lỏng dưới áp suất cao.


-

Hệ số dung lượng k

6


Trong đó:
Vs : thể tích pha tĩnh; Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh; Qm: lượng chất trong pha động
Cần chọn cột, pha động ... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu 1 < k’< 8.
- Hệ số chọn lọc 

Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1. Để tách riêng
2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0.
- Hệ số bất đối xứng As
Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.
Trong đó:
W1/20 : chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2. Giá trị của As càng
gần 1 thì pic càng cân đối.
- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số Số đĩa lý thuyết N của cột:

Trong đó:
W: chiều rộng đo ở đáy pic.
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội
và mẫu thử có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng
trong mẫu thử một cách chính xác.
- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết
của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến
hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu


thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng
của diện tích hoặc chiều cao pic.
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một
chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích
pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò
huỳnh quang
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang dựa
trên cơ chế hấp phụ – chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ
và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ). Sắc kí hấp phụ được dùng nhiều để
tách các chất tương đối ít phân cực, các chất hữu cơ không tan trong nước
có phân tử lượng nhỏ hơn khoảng 5000đvC. Phương pháp này mạnh hơn
hẳn các phương pháp khác trong việc tách đồng phân.
Hiện tượng huỳnh quang
Hiện tượng quang – phát quang là sự hấp thụ ánh sáng có bước sóng
này để phát ra ánh sáng có bước sóng khác thường trong miền ánh sáng nhìn
thấy. Định luật Stokes về sự phát quang: ánh sáng phát quang có bước sóng
dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích λpq > λkt.
Huỳnh quang là sự phát quang (phát xạ bức xạ điện từ, thường là ánh
sáng nhìn thấy) thường xảy ra với chất lỏng và chất khí khi phân tử hấp thụ
năng lượng dạng nhiệt (phonon) hoặc dạng quang (photon). Hiện tượng phát
huỳnh quang có thời gian phát quang ngắn, huỳnh quang tắt sau khi ngừng

10 a.u
10-8
Huỳnh quang
Chọn lọc
8-25
10-7 a.u
10-12
Đo độ dẫn
Chọn lọc
1-5
10-2 μS/cm
10-7
Đo chỉ số khúc xạ Phổ thông
5-15
10-7 r.i.u
10-6
Đầu dò huỳnh quang là ứng dụng của quang phổ huỳnh quang. Phổ
huỳnh quang là phổ phát xạ phân tử. Sau khi hấp thụ năng lượng của bức xạ
tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức xạ kích thích), phân tử bị
kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức
xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang F của một dung
dịch loãng tỉ lệ thuận với nồng độ C (mol/l) trong điều kiện xác định khi
cường độ và bước sóng kích thích là hằng số. Việc đo phổ huỳnh quang chỉ
nên tiến hành với dung dịch loãng C < 10-4 mol/l để tránh ảnh hưởng suy giảm
cường độ của bức xạ phát ra [6].

Hình 4. Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang


Đầu dò huỳnh quang (FLD) là đầu dò nhạy nhất trong số các đầu dò


thiệu hai phương pháp quang phổ phân tử định lượng flurbiprofen. Phương
pháp được tiến hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH và EMA [11].
Trong quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp
thụ quang, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV – Vis hai chùm tia
(HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet 1 cm, tốc độ quét
600 nm/phút, dải quét 190 – 320 nm, độ rộng khe 2 nm. Tín hiệu được xử lý
trên phần mềm Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0
trong hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng
nồng độ 1 – 14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn định lượng
(LOD) là 0,60 μg/ml.
Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen
bằng máy đo huỳnh quang. Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang
SHIMADSU RF–5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ
rộng khe 5,0 nm, bước sóng kích thích λex= 248 nm, bước sóng phát xạ λem=
308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên
bản 10.0 trong hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong
khoảng nồng độ 0,05 – 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,8% và LOQ có
giá trị là 0,03 μg/ml.
Các phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện ngắn, ít tốn
kém, độ chính xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các
nồng độ rất nhỏ. Vì vậy, những phương pháp này có thể được sử dụng thành
công để phân tích dược phẩm, liên quan đến kiểm soát chất lượng sản phẩm
thương mại và nghiên cứu dược động học. Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc
hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi các tạp chất lạ và phải kết hợp với các
phương pháp khác để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu.
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
USP 40 – NF 35 [15] và BP 1993 [29] đều đề xuất phương pháp
HPLC để phân tích flurbiprofen tinh khiết và ở dạng phân liều (thuốc viên và
thuốc nhỏ mắt). Cả hai phương pháp đều đề nghị sử dụng pha động

lệch chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34% [2].
Phương pháp có những ưu điểm là độ chính xác cao, nhạy với các nồng
độ nhỏ, tính đặc hiệu cao nên có khả năng tách các chất ra hoàn toàn và có thể
áp dụng được cho những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi. Đặc biệt đầu dò
DAD có khả năng quét phổ hấp thụ, ứng dụng trong kiểm tra độ tinh khiết của


mẫu. Nhược điểm của phương pháp là phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền
và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc hiện đại.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ


Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen
và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng
hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC – MS/MS) [22,
24, 26, 27].
Nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng phương
pháp LC–MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin, Jing Jin,
Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng Zheng,
Hui Chen thực hiện (2015) [24] sử dụng hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu
UFLC LC–30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối phổ
QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ). Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ thuật
ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Điều kiện chạy nguồn
hoá ESI liệt kê trong bảng 2.
Bảng 2. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI
Thông số

Giá trị

Áp suất khí phun

0,1

0,4

Kênh B:
Kênh A: Nước:
Acetonitril: Acid
Acid formic (99,9 :
formic
0,1; v/v)
(99,9 : 0,1; v/v)
60

40


0,6

0,4

15

85

1

0,4

5


phân tách bởi cột Luna C8(II) (50 mm L × 3 mm ID) (Phenomenex, Torrance,
CA) với thời gian cho 1 lần chạy mẫu là 20 phút. Flurbiprofen và 4 –
hydroxyl – flurbiprofen được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang còn các
chất còn lại (dextromethorphan, dextrorphan, midazolam và 1 – hydroxyl –
midazolam) được phát hiện bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ
bắn phá ion dương. Hệ thống sắc ký (Shimadzu, Nhật Bản) bao gồm hai máy
bơm LC–10ADVP, một máy khử khí DGU–14A và một bộ lấy mẫu tự động
SIL–10ADVP. Đầu dò sử dụng là đầu dò huỳnh quang RF10–XL (Shimadzu,
Nhật Bản) ghép đầu dò khối phổ LCMS–2010A (Shimadzu, Nhật Bản). Pha
động bao gồm methanol (dung môi A) và đệm ammonium acetate 20 mM
(điều chỉnh đến pH 3,9 với axit formic) (dung môi B). Tốc độ dòng 0,2 ml /
phút và thực hiện sắc ký ở nhiệt độ môi trường. Nồng độ của methanol trong
dung môi tăng từ 40% tại thời điểm tiêm mẫu đến 90% sau 10 phút và duy trì
đến hết quá trình sắc ký (20 phút). Flurbiprofen và 4 – hydroxyl flurbiprofen
được cài bước sóng kích thích λ Ex = 260nm và bước sóng phát xạ λEm =
320nm [21]. Có thể thấy cặp bước sóng kích thích λEx = 260nm và bước sóng


phát xạ λEm = 320nm được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác [19, 30].
Một nghiên cứu đã mô tả phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
đảo để xác định flurbiprofen trong huyết thanh người với mục đích nghiên
cứu dược động học đã sử dụng pha động axetonitrile : nước : acid phosphoric
(650 : 350 : 0,5; v/v/v). Tốc độ dòng là 1,0 ml / phút, thể tích tiêm mẫu 20ml
và thời gian chạy cho mỗi mẫu là 8 phút. Quy trình định lượng sử dụng đầu
dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λEx = 250nm và bước sóng phát xạ
λEm = 315nm. Thời gian lưu của flurbiprofen và acid 4 – biphenylacetic lần
lượt là 5 phút và 6,1 phút [9].
Nghiên cứu của Knadler và các cộng sự (1989) lại sử dụng pha động là
acetonitril : nước (62 : 38) với tốc độ dòng 1ml/phút qua cột C18. Quy trình
định lượng sử dụng đầu dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λ Ex =