BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH CÔNG THANH

GIÁ TRỊ CỦA THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN
NS1 VÀ CÁC YẾU TỐ DỊCH TỄ, LÂM SÀNG, HUYẾT HỌC
VÀ SINH HÓA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG SỚM
SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE NẶNG Ở TRẺ EM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH CÔNG THANH

GIÁ TRỊ CỦA THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN
NS1 VÀ CÁC YẾU TỐ DỊCH TỄ, LÂM SÀNG, HUYẾT HỌC
VÀ SINH HÓA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG SỚM
SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE NẶNG Ở TRẺ EM


Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.............................................................................. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 5
1.1. Lịch sử của vấn đề nghiên cứu .................................................................... 5
1.2. Xét nghiệm chẩn đoán SXHD ..................................................................... 8
1.3. Tiên lượng sớm SXHD nặng ....................................................................... 22
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................................ 29
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 37
2.3. Các sai lệch và biện pháp khắc phục........................................................... 54
2.4. Vấn đề y đức trong nghiên cứu.................................................................... 55
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................... 56
3.1. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của mẫu
nghiên cứu.............................................................................................................. .56
3.2. Giá trị của xét nghiệm nhanh phát hiện NS1 virút dengue trong chẩn
đoán SXHD ở dân số nghiên cứu ........................................................................ 65


3.3. Mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết học và sinh hóa
trong 72 giờ đầu với SXHD, mô hình chẩn đoán sớm SXHD ............................... 69
3.4. Mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ, lâm sàng và cận lâm sàng trong 72
giờ đầu với SXHD nặng ................................................................................................ 73
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 77
4.1. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của mẫu
nghiên cứu.............................................................................................................. 77
4.2. Giá trị của xét nghiệm nhanh phát hiện NS1 virút dengue trong
chẩn đoán SXHD ở dân số nghiên cứu .......................................................... 84
4.3. Mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết học và sinh


Creatin kinase

- DENV

Dengue virus

- DHCB

Dấu hiệu cảnh báo

- ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men

- Hct

Hematocrit

- IFN-ɤ

Interferon gamma

- IL

Interleukin

- NS1



Bảng 2.2. Lịch thu nhận máu và lượng máu lấy ............................................. 46
Bảng 2.3. Ngưỡng phát hiện của xét nghiệm one-step real-time multiplex
RT-PCR .......................................................................................... 49
Bảng 3.1. Đặc điểm của dân số nghiên cứu .................................................... 57
Bảng 3.2. Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng trong 72 giờ đầu của những
trường hợp SXHD .......................................................................... 60
Bảng 3.3. Đặc điểm cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của những trường
hợp SXHD ...................................................................................... 61
Bảng 3.4. Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng trong 72 giờ đầu của những
trường hợp SXHD nặng ................................................................. 64
Bảng 3.5. Đặc điểm cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của những trường
hợp SXHD nặng ............................................................................. 65
Bảng 3.6. Bảng kết quả NS1 Ag Strip ............................................................ 66
Bảng 3.7. Giá trị của thử nghiệm NS1 Ag Strip ............................................. 66
Bảng 3.8. Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ và lâm
sàng trong 72 giờ đầu với SXHD ................................................... 70
Bảng 3.9. Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố cận lâm sàng
trong 72 giờ đầu với SXHD ........................................................... 71


Bảng 3.10. Kết quả phân tích đa biến mối liên quan giữa các yếu tố dịch
tễ lâm sàng và cận lâm sàng trong 72 giờ đầu với SXHD........... 72
Bảng 3.11. Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ và
lâm sàng trong 72 giờ đầu với SXHD nặng................................. 74
Bảng 3.12. Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố cận lâm sàng
trong 72 giờ đầu với SXHD nặng ................................................ 75
Bảng 4.1. So sánh giá trị thử nghiệm nhanh NS1 Strip ở các nơi và so
với các xét nghiệm NS1 ELISA và xét nghiệm nhanh khác ........ 85


Biểu đồ 3.8. Tỉ lệ NS1 dương tính theo ngày bệnh ........................................ 67
Biểu đồ 3.9. Tỉ lệ NS1 dương tính theo týp huyết thanh ................................ 68
Biểu đồ 3.10. Tỉ lệ NS1 dương tính theo đáp ứng miễn dịch ......................... 68


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sốt xuất huyết dengue (SXHD) là bệnh nhiễm siêu vi do muỗi lây truyền
có tốc độ lan nhanh nhất trên thế giới. Trong hơn 50 năm qua, tần suất mới
mắc tăng lên gấp 30 lần với sự mở rộng vùng địa lý sang những quốc gia mới,
từ thành thị đến nông thôn. Ở những vùng có dịch, SXHD là một trong những
nguyên nhân hàng đầu gây nhập viện và tử vong ở trẻ em. Ước tính trên toàn
thế giới, có trên 3 tỉ người sống trong vùng dịch tễ dengue trên hơn 100 quốc
gia, hằng năm có khoảng 100 triệu trường hợp bệnh có biểu hiện lâm sàng,
khoảng 2% đến 5% trong số đó là nặng [124].
SXHD là một bệnh hệ thống và “động”, với diễn tiến bệnh và kết cuộc
khó đoán trước. Biểu hiện có thể từ không triệu chứng đến sốc, xuất huyết
nặng có thể gây tử vong. Hầu hết các trường hợp bệnh tự giới hạn và hồi
phục, tuy nhiên có tỉ lệ nhỏ các trường hợp bệnh diễn tiến nặng, đa số đặc
trưng bởi thất thoát huyết tương có thể kèm theo xuất huyết.
Ở hầu hết các quốc gia đang phát triển có những bệnh dịch gây sốt như
sởi, sốt thương hàn, leptospirosis hay các dịch bệnh do vi rút đường hô hấp
khác. Trong vài ngày đầu của sốt, các bệnh này có thể giống nhau về biểu
hiện lâm sàng như đau đầu, đau cơ và phát ban gây khó khăn cho công việc
chẩn đoán của các bác sĩ tuyến cơ sở. Các dấu hiệu của SXHD như xuất huyết
hay thất thoát huyết tương thường thấy sau giai đoạn sốt cấp thoái lui, điển
hình là sau ngày 3 hay 4 của sốt. Và những dấu hiệu cảnh báo (DHCB) cũng
như dấu hiệu nặng của bệnh cũng xuất hiện trong giai đoạn này. Một số bệnh
nhân sốt nghi ngờ SXHD, kể cả các bệnh sốt khác bị nhập viện theo dõi

diễn tiến nặng dẫn đến tử vong. Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) năm 2009
đã đưa ra các dấu hiện cảnh báo các trường hợp có thể diễn tiến nặng, tuy
nhiên những dấu hiệu và triệu chứng này thường xuất hiện sau 72 giờ. Do đó,
việc nhận diện nhóm bệnh nhân nguy cơ bị SXHD nặng trong giai đoạn sớm
trước 72 giờ sẽ giúp các bác sĩ cho nhập viện và theo dõi sát phát hiện sớm
biến chứng nặng để điều trị kịp thời. Ngoài ra, nó sẽ gợi ý cho việc nhắm đến


3

những chiến lược tiêm ngừa và những thử nghiệm lâm sàng can thiệp điều trị
trong tương lai.
Vì những lý do trên, chúng tôi đặt ra câu hỏi nghiên cứu giá trị của thử
nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 trong chẩn đoán sớm SXHD tại Tiền
Giang là như thế nào và vai trò của các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết học và
sinh hóa trong chẩn đoán sớm SXHD từ đó xây dựng mô hình chẩn đoán sớm
SXHD cũng như vai trò của các yếu tố này trong tiên lượng sớm SXHD nặng
ở trẻ em ra sao? Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Giá trị của thử
nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 và các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết
học và sinh hóa trong chẩn đoán và tiên lượng sớm SXHD nặng ở trẻ em”.
Nghiên cứu này là một nhánh của nghiên cứu đa trung tâm của Đơn vị nghiên
cứu lâm sàng Đại học Oxford- Việt Nam (OUCRU-VN) hợp tác thực hiện tại
5 tỉnh thành phía Nam, trong đó có Tiền Giang.


4

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, huyết học và sinh hóa trong 72 giờ đầu của
SXHD.

cảnh lâm sàng và dịch tễ hay gặp ở Bắc Mỹ trong suốt thế kỷ 18 và 19.
DENV gần như chắc chắn là nguyên nhân của bệnh sốt 5 đến 7 ngày gây ra ở
những thực dân Châu Âu tại Châu Á nhiệt đới trong suốt giai đoạn này. Căn
bệnh tương tự cũng xảy ra ở những thực dân tại Châu Úc nhiệt đới.
Vào năm 1801, nữ hoàng Tây Ban Nha đã dùng thuật ngữ “dengue” để
mô tả căn bệnh sốt cấp xảy ra ở các thành viên trong triều đình Tây Ban Nha
với các triệu chứng đau nhức xương khớp, xuất huyết và vàng da [175]. Trận
dịch lớn ở Caribe năm 1828, xảy ra ở một cộng đồng đa chủng tộc, đa ngôn


6

ngữ đã giúp quốc tế hóa việc sử dụng thuật ngữ “dengue” cho căn bệnh này
và dùng trong y văn liên tục đến ngày nay.
Sự phát hiện tác nhân và nhận diện vật truyền bệnh [162]
Các nhà nghiên cứu đã sớm có gợi ý rằng DENV được truyền qua muỗi,
nhưng đến năm 1906, sự truyền bệnh thật sự do một vật truyền bệnh thật sự,
muỗi Aedes aegypti, mới được Bancroft chứng minh. Simmons cũng chứng
minh vai trò của Aedes albopictus trong việc lây truyền DENV. Sau đó, một
số loài Aedes khác cũng thấy có vai trò lây lan bệnh.
Kimura and Hotta là những người đầu tiên phân lập được DENV từ mẫu
máu của những bệnh nhân trong trận dịch dengue tại Nagasaki, Nhật Bản năm
1943 và từ đó đã mở ra kỷ nguyên mới cho các nghiên cứu về dengue [162].
Trong các trận dịch dengue từ năm 1897 đến 1902 ở Úc, năm 1928 ở Hy Lạp
và năm 1931 ở Đài Loan, người ta đã mô tả một hội chứng nặng đặc trưng với
sốc, xuất huyết và tử vong. Đến năm 1960, trong khi nghiên cứu về bệnh bại
liệt ở Philippin, Hammon đã phân lập được 2 týp virút dengue mới, gọi là
DENV-3 và 4 [61].
Hội nghị Các bệnh SXH do muỗi được TCYTTG tổ chức tại Bangkok từ
ngày 19 đến 24 tháng 10 năm 1964 đã giới thiệu thuật ngữ “SXHD” [59].

TCYTTG, so với tình hình chung của thế giới trong giai đoạn 2004-2010,
Việt Nam là quốc gia đứng thứ 3 về số ca mắc SXHD trung bình mỗi năm
[66].
Trong những năm gần đây, bệnh sốt xuất huyết đã giảm, có tỉ lệ mắc
trên/100.000 dân là 56,7, thấp hơn so với một số nước và tỉ lệ phần trăm tử
vong/ mắc (0,029) thấp nhất so với các quốc gia trong khu vực. Trong 7 tháng
đầu năm 2017 ghi nhận 58.888 trường hợp mắc, trong đó có 50.497 trường
hợp nhập viện và 17 trường hợp tử vong [3].
Tại Tiền Giang, kể từ trận dịch đầu tiên vào năm 1960 xuất hiện ở Cái
Bè được mô tả và xác định, SXHD đã phát thành dịch lớn vào các năm 1979,
1983, 1987, 1988. Theo số liệu Hội nghị giao ban Công tác điều trị SXHD


8

khu vực phía Nam, trong năm 2017 Tiền Giang không còn nằm trong 10 tỉnh
có số trường hợp mắc SXHD cao nhất cả nước nhưng lại là một trong 12 tỉnh
có số tử vong cao nhất (2 trường hợp) [2]. Tỉnh Tiền Giang nằm trong vùng
khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm thuộc vùng đồng bằng Sông Cửu Long có
khí hậu với nhiệt độ cao ổn định (nhiệt độ trung bình 26,90C), lượng mưa
(lượng mưa trung bình 1450 mm) và độ ẩm (83%) thích hợp để muỗi sống
sót, sinh sản và phát triển. Song song đó, tình trạng đô thị hóa diễn ra nhanh,
mật độ cân cư khá đông cùng với tập quán sinh hoạt của người dân đã tạo
điều kiện thuận lợi cho bệnh SXHD lây lan và diễn ra quanh năm.
1.2. XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN SXHD
1.2.1. DENV:
Vi rút gây bệnh SXHD thuộc họ Flaviviridae, giống flavivirut. DENV
cấu tạo bởi một ARN sợi đơn cực dương, khoảng 11.000 nucleotide, nằm
trong lõi capsid hình khối hai mươi mặt, đường kính 30 nm, bên ngoài là vỏ
lipo-protein tạo thành khối cầu (đường kính 50 nm). Các protein cấu trúc lõi

thay đổi tùy thuộc vào tình trạng sơ hay tái nhiễm bệnh, vì thế việc chẩn đoán
huyết thanh học bệnh SXHD cũng tùy thuộc vào giai đoạn bệnh. Hình 1.2 mô
tả các thời điểm phát hiện DENV và các kháng thể IgM, IgG thông thường
trong sơ nhiễm.


10

Nhiều năm
3 tháng
1

2

3

4

5

6

7

8

9 14 ngày
Phát hiện IgG

Phân lập vi rút

diện. Ví dụ, những trường hợp chủng ngừa viêm não Nhật Bản sau đó nhiễm
DENV phát triển nhiều kháng thể IgM hơn so với những cá thể nhiễm DENV
lần thứ 2. Tỉ lệ và số lượng kháng thể được sản xuất trong suốt quá trình
nhiễm DENV lần 2 được sử dụng để xác định đáp ứng huyết thanh học đối
với nhiễm DENV. Loại kháng thể chiếm ưu thế là IgG phát hiện với mức cao,
ngay cả trong giai đoạn cấp và tồn tại từ 10 tháng cho đến suốt đời. Mức IgM
ở giai đoạn hồi phục sớm trong tái nhiễm dengue thấp hơn so với sơ nhiễm và
có thể không phát hiện được trong một số trường hợp. Để phân biệt sơ nhiễm
và tái nhiễm dengue, ngày nay người ta thường dùng tỉ lệ kháng thể IgM/IgG
hơn là thử nghiệm HI.

Dengue sơ nhiễm

Ngày sau khi khởi phát triệu chứng

Dengue tái nhiễm

Ngày sau khi khởi phát triệu chứng

Hình 1.3. Mô hình đáp ứng kháng thể trong sơ nhiễm và tái nhiễm
dengue
* “Nguồn: Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh Hoa Kỳ” [35]
Do các kháng thể tăng tương đối chậm nên kết quả huyết thanh học có
thể âm tính trong giai đoạn sớm của bệnh. Chính vì vậy bệnh phẩm cần được


12

thu thập ít nhất 7 ngày sau khi khởi triệu chứng. Kháng thể IgM sinh ra trong
bệnh SXHD phản ứng cao nhất với týp huyết thanh vi rút gây bệnh, nhưng

tương, các tế bào máu tuần hoàn hay các mô khác trong 4-5 ngày đầu. Trong
giai đoạn sớm của bệnh, người ta dùng các phương pháp như phân lập vi rút,
phát hiện acid nucleic hoặc kháng nguyên. Ở cuối giai đoạn cấp, xét nghiệm
miễn dịch học là một phương pháp lựa chọn để chẩn đoán.
Có nhiều phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng để giúp điều trị bệnh
nhân và kiểm soát bệnh. Tùy theo mục đích (như chẩn đoán lâm sàng, khảo
sát dịch tễ, phát triển vắc xin), trang bị xét nghiệm và sự thông thạo kỹ thuật
tại chỗ, chi phí và thời điểm lấy máu mà người ta lựa chọn phương pháp chẩn
đoán nào.
Giai đoạn vi rút huyết trong dengue ở bệnh nhân thì ngắn, điển hình xuất
hiện 2-3 ngày trước khởi sốt và kéo dài trong 4-7 ngày bệnh. Trong suốt giai
đoạn này, có thể phát hiện DENV, axit nucleic của nó và kháng nguyên vi rút
lưu hành [147].

Hình 1.4. Biểu đồ thời gian của sơ nhiễm và tái nhiễm dengue cùng các
phương pháp có thể sử dụng để phát hiện nhiễm vi rút.
“Nguồn: TCYTTG, 2009” [145].


14

1.2.3.2. Các phương pháp chẩn đoán để phát hiện nhiễm dengue
[147]
Chẩn đoán xác định nhiễm dengue bởi các xét nghiệm: phát hiện vi rút,
bộ gien vi rút hay kháng nguyên NS1, hoặc đảo ngược huyết thanh của IgM
hoặc IgG trong mẫu huyết thanh kép (IgM/IgG chuyển từ âm sang dương tính
hoặc tăng gấp 4 lần hiệu giá kháng thể chuyên biệt).
Tiêu chuẩn chẩn đoán một trường hợp có thể nhiễm dengue là huyết
thanh học IgM dương tính hoặc hiệu giá kháng thể xét nghiệm ức chế ngưng
kết hồng cầu có giá trị từ 1/1280 trở lên.


Mô tử thiết

Đảo ngược huyết IgM chuyển từ (-) sang (+) Huyết thanh cấp
trong mẫu huyết thanh kép (ngày

1-5)

và

Đảo ngược huyết IgG chuyển từ (-) sang (+) huyết

thanh

hồi

thanh IgM

thanh IgG

trong mẫu huyết thanh kép phục (15-21 ngày
hoặc IgG tăng gấp 4 lần sau

mẫu

huyết

giữa 2 mẫu huyết thanh thanh đầu)
kép
Có

phòng thí nghiệm chuyên nghiệp. Ngoài ra, một số chủng vi rút không dễ
dàng phát hiện vì nồng độ vi rút thấp trong mẫu bệnh phẩm.
1.2.3.4. Phát hiện axit nucleic vi rút [146]
Phát hiện RNA DENV từ máu, huyết tương và huyết thanh bằng phản
ứng khuếch đại gien phiên mã ngược (RT-PCR) là một phương pháp nhạy,
chuyên biệt và nhanh chóng để xác định nhiễm dengue. Chúng cho độ nhạy
và độ đặc hiệu tốt hơn khi so với phân lập vi rút với thời gian quay vòng
nhanh hơn nhiều.
Tất cả những xét nghiệm phát hiện axit nucleic liên quan đến 3 bước cơ
bản: (i) chiết tách axit nucleic và tinh chế; (ii) khuếch đại axit nucleic; (iii)
phát hiện sản phẩm khuếch đại. Có thể xảy ra kết quả dương tính giả và có thể
phòng ngừa điều này bằng cách cô lập chính xác các bước khác nhau của xét
nghiệm và quan sát quy trình khử nhiễm nghiêm ngặt.