BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THU GIANG
1201139

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA INVITRO CỦA CAO CÂY LÁ ĐẮNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THU GIANG
1201139

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA INVITRO CỦA CAO CÂY LÁ ĐẮNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Thái Hà Văn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dƣợc học cổ truyền



2.1.3. Hóa chất, thuốc thử ..........................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................16
2.2.1. Điều chế cao chiết ethanol lá đắng ..................................................16
2.2.2. Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá
đắng….. .........................................................................................................16
2.2.3. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao chiết ethanol lá đắng 16
2.2.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol lá
đắng….. .........................................................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................17
2.3.1. Phương pháp điều chế cao ...............................................................17
2.3.2. Phương pháp xác định độ ẩm ..........................................................18
2.3.3. Phương pháp cảm quan ...................................................................18
2.3.4. Phương pháp định tính .....................................................................18
2.3.5. Phương pháp bán định lượng ..........................................................22
2.3.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro .......................................24
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................27
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................28
3.1. Điều chế cao chiết ethanol lá đắng .........................................................28
3.2. Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá đắng .....29
3.2.1. Định tính ...........................................................................................29
3.2.2. Bán định lượng .................................................................................32
3.2.2.2. Thẩm định phương pháp HPTLC..................................................34
3.3. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao chiết ethanol cây lá đắng........37
3.3.1. Tính chất: .........................................................................................37
3.3.2. Độ ẩm: ..............................................................................................37
3.3.3. Định tính: .........................................................................................38
3.3.4. Bán định lượng luteolin bằng HPTLC: ............................................38



Bảng 3.1. Hàm lượng chiết cao lá đắng ethanol 70%

28

Bảng 3.2. Định tính các thành phần có trong cao

29

Bảng 3.3. Kết quả phân tích sắc ký đồ cao lá đắng sau khi phun

31

thuốc thử ở bước sóng 254 nm
Bảng 3.4. Thể tích tiêm mẫu

32

Bảng 3.5. Hàm lượng luteolin có trong cao cây lá đắng

33

Bảng 3.6. Diện tích pic của 6 lần tiêm chuẩn

36

Bảng 3.7. Hàm lượng luteolin chuẩn và diện tích pic đáp ứng

36

Bảng 3.8. Độ ẩm cao

31

Hình 3.2. Sắc ký đồ định lượng bằng HPTLC ở bước sóng 254

33

nm
Hình 3.3. Hình dạng pic và Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn

35

Đồ thị 3.1. Đường chuẩn phân tích nồng độ luteolin theo diện

34

tích pic
Đồ thị 3.2. Mối liên hệ giữa hàm lượng luteolin và diện tích pic

36

Đồ thị 3.3. Khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây lá đắng

41

Đồ thị 3.4. Khả năng chống oxy hóa của chất đối chứng
quercetin

41



trong một thời gian dài và được nhân dân ta sử dụng như một loại rau xanh ăn
hằng ngày hoặc thảo dược để phòng và điều trị các bệnh như: tiểu đường,
lipid máu, các bệnh chuyển hoá liên quan đến gan...
Trong bối cảnh cây lá đắng ngày càng được sử dụng rộng rãi, xuất hiện
nhiều nghiên cứu về đặc điểm thực vật cũng như thành phần hoá học của cây.
Các nghiên cứu này đã khẳng định được cây lá đắng di thực vào Việt Nam là
loài Vernonia amygdalina Del. và ít nhiều khẳng định được các tác dụng sinh
học của cây lá đắng thông qua việc phát hiện các hợp chất hoá học liên quan.
Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu chính thức nào tiến xa hơn trong việc đưa
cây lá đắng tiếp cận gần hơn với người sử dụng. Việc chế biến và sử dụng lá
đắng vẫn còn rất thủ công. Người dân chủ yếu dùng lá tươi hoặc đã phơi khô
hãm uống như chè hoặc nấu thành canh để ăn.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành
phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng” với
mục đích đưa ra bào chế cao giúp cho việc sử dụng loại dược liệu này được
thuận tiện, dễ dàng hơn và bước đầu nghiên cứu tác dụng của cây lá đắng. Để
hoàn thành mục đích đó chúng tôi tiến hành để tài với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cao cây lá đắng.
2. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên in vitro của cao cây lá đắng.
Để thực hiện các mục tiêu trên đề tài cần thực hiện những nội dung sau:
1. Khảo sát một số tiêu chuẩn cao về cảm quan, độ ẩm, định tính các
thành phần hóa học, định tính và bán định lượng luteolin.
2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng.

1


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1.


1.1.2.1. Đặc điểm thực vật
Loài V.amygdalina Del. có các đặc điểm sau [4]:
Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao 1,5 – 3 m. Thân vừa phải phân nhiều
nhánh, thân cây non có góc cạnh, gần như nhẵn ở dưới, nhiều lông bao phủ
bên ngoài.
Lá mọc cách, nhiều hình dạng và kích thước, hình mác, một số hình
trứng, kích thước 3 – 17 x 1,3 – 7 cm, đỉnh lá nhọn, mép lá có khía răng cưa,
mặt trên lá nhẵn, có nhiều lông mềm, mặt dưới của lá và gân có màu nhạt
hơn, có lông, vị đắng. Cuống lá dài 1 – 4 cm, có nhiều lông mịn.
Cụm hoa đầu với nhiều lá bắc nhỏ, dài 0,1 – 0,2 cm; có mùi thơm, có
cuống ngắn. Đầu mang hoa có 11 – 35 hoa lưỡng tính, hình chuông rộng 0,2 –
0,5 cm, đế hoa nhỏ dài 0,2 – 0,5 cm, màu trắng kem. Tổng bao 25 – 30 lá bắc
xếp 4 – 5 hàng, hình trứng hoặc hình chữ nhật hoặc nhọn, dài 0,4 – 0,6 cm,
màu xanh hơi nâu ở đỉnh, hình dài hẹp, vòng trong dài hơn vòng ngoài.
Tràng hoa thu hẹp dần bên dưới. Bộ nhị dài 4,5 – 5 mm, với 5 chỉ nhị,
bao phấn dính nhau thành ống dài 3 – 4 mm, dính nhau ở đuôi. Chỉ nhị dài 11

3


– 14,5 mm; bao phấn thuôn dài hình elip, kích thước 2 – 2,5 x 0,5 – 0,9 mm.
Vòi nhụy dài 8 – 9,5 mm, phía trên tách ra mang 2 đầu nhụy.
Quả bế hình elip thuôn dài, 3 – 4 x 0,5 – 1 mm, quả có 10 gân. Túm
lông với những sợi lông cứng loe ra ở đầu.
1.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Lá đắng có nguồn gốc từ Châu Phi, đã di thực về Việt Nam. Lá đắng rất
dễ trồng, chủ yếu bằng cách giâm cành.
1.1.2.3. Thành phần hóa học
Lá cây được dùng làm thực phẩm rau xanh ăn hàng ngày do có hàm
lượng chất dinh dưỡng, vitamin và khoáng chất tương đối dồi dào [17], [25].

ký sinh trùng sốt rét.

R1

R2

A1

β-OH, H

H

A2

α-OH, H

H

A3

O

H

B1

H, H

OH




- Điều trị các bệnh qua đường tình dục như bệnh lậu nhờ tác dụng của
các chất chống oxy hóa trong lá.
- Chống giun sán.
- Duy trì sức sống tình dục. Giúp nhuận tràng và chữa táo bón.
- Chống sốt rét vì chất đắng trong lá có thể thay thế cho quinin.
- Chữa đau họng, ho, trừ đờm, chỉ cần nhai 1 lá trước khi đi ngủ vào ban
đêm và sáng sớm sẽ thấy giảm các triệu chứng ho.
- Tăng cường khả năng sinh sản, uống nước lá đắng giúp kích thích khả
năng sinh sản ở phụ nữ khó sinh. Các lá có chứa nhiều carotene, giúp
cân bằng quá trình tổng hợp các hormon sinh dục nữ và duy trì nồng độ
estrogen đo đó giúp phụ nữ khỏe mạnh và kéo dài tuổi xuân.
- Chống buồn nôn và tăng cường cảm giác ngon miệng.
- Hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi B và C.
- Tăng tiết sữa cho con bú.
- Giảm đau và làm êm dịu thần kinh dễ ngủ. Chống mẩn ngứa ngoài da.
Độc tính của lá đắng rất thấp nên có thể sử dụng lâu dài an toàn [22], [25].
Trên thực nghiệm, dịch chiết nước từ lá có độc tính rất thấp nên có thể dùng
liều cao mà vẫn an toàn trong điều trị bệnh cho người [25].
1.2.

Sự hình thành các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống
oxy hóa (CCOH) trong cơ thể

1.2.1. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động
Trong chuỗi hô hấp tế bào oxy nhận điện tử và kết hợp với hydro tạo
thành nước. Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế qua
nhiều giai đoạn và mỗi giai đoạn chỉ nhận một điện tử. Đầu tiên, oxy nhận
một điện tử từ phân tử cytochrom tạo thành gốc superoxyd (

GSHPO

Với hằng số tốc độ k2 = 108M/s.
Bình thường do k1 và k2 rất lớn nên chủ yếu sản phẩm của quá trình hô
hấp là nước. Tuy nhiên trong cơ thể vẫn tồn tại một lượng rất nhỏ H2O2 và
. Đây là 2 chất có tính chất oxy hóa mạnh, do chuyển động nhiệt hoàn
toàn ngẫu nhiên mà chúng va đập phản ứng với nhau tạo ra 1O2 (oxy đơn bội)
và •OH (gốc hydroxyl). Đây là 2 tiểu phân có khả năng phản ứng rất cao.
Chúng tấn công vào các tổ chức của cơ thể tạo ra các gốc tự do mới như LO•
(alkoxyl), LOO• (peroxyl)…
Các gốc tự do của oxy và các dạng oxy có khả năng phản ứng cao như
vậy được gọi là các dạng oxy hoạt động hay các oxydant [1], [10], [12].
1.2.2. Hệ thống các chất chống oxy hóa (CCOH) trong cơ thể
Trong cơ thể có một hệ thống các chất trung hòa hoặc phân hủy các dạng
oxy hoạt động trên và được gọi là các CCOH hay các oxydant bao gồm: ([1],
[10], [12]).

8


- Enzym superoxyd dismutase (SOD)
Có 2 loại SOD:
 MnSOD có ở ty thể.
 CuZnSOD có ở bào tương.
Cả 2 loại này đều phân hủy đặc hiệu

theo phản ứng (1).

- GSH và GSHPO:
Cơ chất và enzym này phân hủy các peroxyd và H2O2 theo phản ứng:

tương không đủ transferin và phản ứng Fenton xảy ra rất nhanh.
 Lactoferin: Làm mất hoạt tính xúc tác của sắt trong các dịch trên.

9


 Celuroplasmin: Là 1 protein chứa đồng. Nó có khả năng tạo
phức với đồng làm mất hoạt tính xúc tác phản ứng Fenton của
đồng, nó cũng oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản sự tạo thành
các gốc oxy hoạt động từ phản ứng Fenton.
1.2.3. Sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý
1.2.3.1. Gốc tự do với một số quá trình viêm
Khi tác nhân gây viêm (vi khuẩn, dị vật…) xâm nhập vào cơ thể thì các
tế bào ở đó bị kích thích tiết ra các yếu tố hóa ứng động, hấp dẫn bạch cầu
đến làm nhiệm vụ thực bào. Khi tiếp xúc với vi khuẩn hoặc các tác nhân lạ,
bạch cầu mọc ra các giả túc, bao lấy chúng. Khi màng bao quanh đã được
khép kín, ở bạch cầu có sự tăng đột ngột chuyển hóa oxy để sinh ra

, OH•,

H2O2… nhằm mục đích tiêu hủy các tác nhân này. Để bảo vệ mình, bạch cầu
cũng sản sinh ra rất nhiều các chất chống oxy hóa như SOD, GSH, catalase…
song vẫn có khoảng 10% bạch cầu chết, do chính các dạng oxy hoạt động mà
nó sinh ra. Khi bạch cầu bị ly giải, các gốc tự do của oxy thoát ra ngoài, tấn
công vào các tế bào xung quanh, gây tổn thương làm cho sự đáp ứng kích
thích của tế bào ở khu vực đó càng xảy ra mạnh hơn, những đáp ứng đó tương
ứng trên lâm sàng là các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau ( viêm) [10].
1.2.3.2. Gốc tự do với các bệnh tim mạch
Bệnh tim mạch thường là bệnh của người già. Bởi vì khi già thì các
DOXHĐ tăng, các CCOH giảm. Chính sự chuyển dịch cân bằng các DOXHĐ

Mặc dù các tác nhân gây ung thư có bản chất hết sức khác nhau: có thể là các
tác nhân vật lý (tia phóng xạ, tia X…), có thể là do tác nhân hóa học (có hàng
nghìn chất hóa học có thể gây ung thư). Song nhìn chung tất cả các tác nhân

11


này khi xâm nhập vào cơ thể, bị chuyển hóa dẫn đến hậu quả làm cho các
DOXHĐ gia tăng [10].
Sự gia tăng của các gốc tự do, điển hình là gốc OH•, sẽ tạo ra điều kiện
cho các gốc này tấn công vào các ADN, gây ra những tổn thương về cấu trúc.
Những tổn thương này không được sửa chữa, di truyền lại tức là đột biến xuất
hiện làm cho tế bào bình thường phát triển dần thành bất thường. Các tế bào
bất thường phát triển mạnh thành u lành và cuối cùng thành u ác tính với các
biểu hiện ung thư lâm sàng [10].
1.2.4. Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa
Có một số phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa như sau:
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO.
- Phương pháp xác định hàm lượng MDA.
- Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II.
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym Xanthin oxydase.
Trong khóa luận này, tôi xin được trình bày phương pháp thử hoạt tính ức
chế gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol cây lá đắng vì phương pháp này có
một số ưu điểm sau:
- DPPH có thể được sử dụng trong các dung môi hữu cơ và dung dịch
nước không phân cực và có thể sử dụng để kiểm tra cả 2 chất chống
oxy hóa ưa nước và ưa mỡ.
- Có độ chính xác cao, dễ dàng thực hiện và giá trị kinh tế cao.
- DPPH được phép phản ứng với toàn bộ mẫu và đủ thời gian nhất định

tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử
dụng.

13


- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): không quá
20%.
- Hàm lượng cồn: đạt 90 – 110% lượng Ethanol ghi trên nhãn (áp dụng
cho cao lỏng và cao đặc).
- Kim loại nặng: đáp ứng yêu cầu quy định trong chuyên luận riêng.
- Dung môi tồn dư: nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước
hay hỗn hợp cồn – nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu
cầu quy định trong Phụ lục 10.14: Xác định dung môi tồn dư – DĐVN
IV.
- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: đáp ứng yêu cầu quy định trong
Phụ lục 12.17: dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật – DĐVN IV.
- Giới hạn nhiễm khuẩn: đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 13.6:
thử giới hạn nhiễm khuẩn – DĐVN IV.

14


Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Lá cây lá đắng. Cây lá đắng đã được giám định bởi ThS. Nghiêm Đức

- Bếp cô cách thủy BATHS.
2.1.3. Hóa chất, thuốc thử
- Chất chuẩn luteolin, quercetin: Trung Quốc.
- DPPH: Nhật Bản.
- Dung môi: n-hexan, ethyl acetat, acid formic, ethanol, butanol,
methanol, acid acetic, aceton, nước cất… đạt tiêu chuẩn phân tích theo
tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Thuốc thử trong phản ứng hóa học: thuốc thử Fehling A, Fehling B;
thuốc thử Buchardat, Dragendoff, Mayer; thuốc thử Lugol, Cianidin;
dung dịch NaOH, dung dịch FeCl3, acid Sulfuric, acid Clohydric…
- Thuốc thử hiện màu: amoniac.
2.2.

Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Điều chế cao chiết ethanol lá đắng
Nghiên cứu bào chế cao từ dược liệu lá đắng: chiết xuất bằng ethanol
70%.
2.2.2. Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá đắng
Định tính, bán định lượng thành phần hóa học của cao.
2.2.3. Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao chiết ethanol lá đắng
- Tính chất.
- Độ ẩm.
- Định tính bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm.

16