BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ NGA

X¸C §ÞNH §éT BIÕN EXON 2, 3 GEN
RHOA
TR£N BÖNH NH¢N UNG TH¦ D¹ DµY
THÓ LAN TáA
Chuyên ngành

: Hóa sinh y học

Mã số

: 60720106

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung


HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn

và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các bệnh nhân và gia đình bệnh nhân
đã giúp đỡ để tôi có thể thực hiện được nghiên cứu này.
Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu
thương của cha mẹ tôi cũng như những người thân trong gia đình cùng bạn
bè, những người đã luôn ở bên tôi, động viên tôi và là chỗ dựa vững chắc cho
tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 09 năm 2018
Người viết cam đoan

Đặng Thị Nga


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Đặng Thị Nga, học viên bác sĩ nội trú khóa 41 Trường Đại học Y Hà
Nội, chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của Cô: PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở
nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, Ngày 10 tháng 09 năm 2018
Người viết cam đoan

Đặng Thị Nga




GDI

Chất ức chế phân ly guanine nuclodide (guanine

GEF

nuclodide-dissociation inhibitors)
Tác nhân trao đổi guanine nucleotide (Guanine

GPCR

nucleotide-exchange factors)
Thụ thể kết cặp G-protein (guanosine nucleotide-binding

IARC

proteins (G proteins) coupled receptors
International Agency for Research on Cancer (Tổ chức

IGF

nghiên cứu ung thư quốc tế)
Insulin-Like Growth Factor (Yếu tố tăng trưởng giống

LOH

Insulin)
Loss of heterozygosity (Đột biến là dạng mất dị hợp tử)


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY...................................................3
1.1.1. Dịch tễ học ung thư dạ dày..................................................................3
1.1.2. Phân loại ung thư dạ dày.....................................................................5
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư dạ dày..................................................7
1.1.4. Chẩn đoán ung thư dạ dày.................................................................14
1.1.5. Điều trị ung thư dạ dày......................................................................16
1.2. GEN RHOA VÀ UNG THƯ DẠ DÀY....................................................18
1.2.1. Sơ lược về gen RHOA......................................................................18
1.2.2. Gen RHOA trong ung thư dạ dày......................................................23
1.2.3. Tình hình nghiên cứu gen RHOA ở bệnh nhân ung thư dạ dày........25
1.3. KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN
GEN RHOA....................................................................................................28
1.3.1. Kỹ thuật PCR....................................................................................28
1.4.2. Kỹ thuật giải trình tự gen..................................................................29
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........33
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..................................................................33
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................33
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu...........................................................................33
2.2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.....................................................33
2.2.3. Phương tiện nghiên cứu....................................................................33
2.2.4. Các bước tiến hành............................................................................35
2.2.5. Phân tích các yếu tố nguy cơ của rượu, thuốc lá...............................38
2.2.6. Phương pháp phân tích số liệu..........................................................39
2.2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu.....................................................39
2.2.8. Sơ đồ nghiên cứu...............................................................................40


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ...............................................................................41
3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................41

PHỤ LỤC


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do UTDD chuẩn hóa theo tuổi ở cả hai giới
theo khu vực......................................................................................4
Hình 1.2. Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren.................................6
Hình 1.3. Vị trí gen RHOA trên nhiễm sắc thể số 3........................................18
Hình 1.4. Con đường RhoA trong tế bào.........................................................20
Hình 3.1. Hình ảnh điện di của exon 2 với mồi RHOA2................................45
Hình 3.2. Hình ảnh điện di của exon 3 với mồi RHOA3................................46
Hình 3.3. Hình ảnh đột biến Y42C exon 2 gen RHOA, bệnh nhân 65360.....47
Hình 3.4. Hình ảnh đột biến G62E exon 3 gen RHOA, bệnh nhân 43570.....47

DANH MỤC BẢN


Bảng 1.1: Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dạ dày...............................7
Bảng 1.2: Đột biến RHOA ở một số nghiên cứu gần đây...............................27
Bảng 2.1. Các biến số nghiên cứu cần thu thập..............................................34
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR cho khuếch đại gen RHOA.................36
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự..................................38
Bảng 3.1. Vị trí tổn thương.............................................................................42
Bảng 3.2. Kích thước tổn thương của u nguyên phát......................................42
Bảng 3.3. Phân bố bệnh nhân theo mức độ xâm lấn u....................................43
Bảng 3.4. Tình trạng sử dụng rượu trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu.........43
Bảng 3.5. Tình trạng hút thuốc lá trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu............44
Bảng 3.6. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA tách từ mẫu mô
parafin của bệnh nhân.....................................................................44
Bảng 3.7. Kết quả đột biến exon 2, 3 gen RHOA của bệnh nhân UTDD thể

ruột, nơi các khối u tăng cường biểu hiện HER2 được điều trị hiệu quả bằng
Trastuzumab [9], [10], hiện nay chúng ta đang thiếu các phương pháp điều trị
đích hiệu quả cho bệnh nhân thể lan tỏa [11]. Sự khác biệt này đang dần được
làm sáng tỏ khi đột biến gen CDH1-gen mã hóa E-cadherin được phát hiện ở
các bệnh nhân UTDD lan tỏa có tính chất gia đình [12], [13] và đột biến gen
RHOA- gen mã hoá RhoA GTPase nhỏ được quan sát thấy ở các bệnh nhân
UTDD thể lan tỏa [14], [15], [16].
Gen RHOA nẳm trên nhánh ngắn NST số 3, mã hóa protein RhoA
GTPase đóng vai trò quan trọng trong sự di chuyển, kết dính, sự sống sót,
phân chia của tế bào và sự biểu hiện gen [17]. RHOA ban đầu được mô tả như


2

một gen sinh ung thư vì sự tăng cường biểu hiện nó dẫn đến chuyển dạng ác
tính và hình thành khối u trong in vivo [18], [19], [20]. Trong thực tế, tăng
cường biểu hiện của gen RHOA được quan sát thấy ở nhiều bệnh lý ác tính và
thường liên quan đến sự tiến triển của nhiều loại ung thư như ung thư vú [21],
u Lympho [22], [23], [24], ung thư gan nguyên phát [25], ung thư đại trực
tràng [26]... Một số nghiên cứu gần đây nhận thấy đột biến gen RHOA xuất
hiện một cách đặc hiệu trong ung thư dạ dày thể lan tỏa và gợi ý rằng đây có
thể là một phân tử đích đầy tiềm năng để điều trị thể ung thư dạ dày có tiên
lượng xấu này [14], [15], [27], [28].
Tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về đột biến gen RHOA ở bệnh
nhân UTDD thể lan tỏa, vì vậy chúng tôi tiến hành để tài “ Xác định đột biến
exon 2, 3 gen RHOA trên bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa” với 2
mục tiêu:
1. Xác định đột biến exon 2, 3 gen RHOA trên bệnh nhân ung thư dạ
dày thể lan tỏa.
2. Đánh giá mối tương quan của đột biến exon 2, 3 gen RHOA với một



4

cao nguyên trong khoảng 55-80 tuổi, tùy thuộc vào sự tác động của các yếu tố
nguy cơ khác nhau [29].

Hình 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do UTDD chuẩn hóa theo tuổi ở cả hai giới
theo khu vực (trên 100.000 người) [3]
1.1.1.2. Tại Việt Nam:
Việt Nam nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc UTDD cao, với tỷ lệ mắc
UTDD chuẩn hóa theo tuổi ở nam là 23,3/100.000 và 10,2/100.000 ở nữ. Ước
tính mỗi năm nước ta có khoảng 15.000 người tử vong do UTDD, chỉ đứng
sau ung thư gan và ung thư phổi [3]. Theo nghiên cứu của Trần Văn Huy tại
Bệnh viện Trung ương Huế năm 2002, trong nhóm bệnh ung thư tiêu hóa,


5

UTDD chiếm tỉ lệ cao nhất (52,4%). Theo tác giả Lại Phú Thưởng và cộng sự
nghiên cứu về UTDD ở 5 tỉnh, thành phố: Hà Nội, Hải Phòng, Thái Nguyên,
Huế và Cần Thơ giai đoạn 2001 – 2004 cho thấy tỷ lệ mắc UTDD ở Hà Nội là
cao nhất, chiếm tỷ lệ 2309/3311 (69,3%). Các tác giả cũng cho thấy, tuổi hay
gặp UTDD ở nước ta là 50 – 60 tuổi, bệnh hiếm gặp ở những người Việt Nam
dưới 40 tuổi.
1.1.2. Phân loại ung thư dạ dày
1.1.2.1. Phân loại theo vị trí
Trên thế giới hiện nay có xu hướng chia UTDD thành 2 loại chính là ung
thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị vì hai loại này khác nhau rất rõ về
dịch tễ, bệnh sinh, mô bệnh học, cũng như cả điều trị và tiên lượng [30], [31].

thể này thường được xem như là thể lan tỏa [6].

A. Ung thư dạ dày thể ruột

B. Ung thư dạ dày thể lan tỏa

Hình 1.2. Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren [6]
Phân loại mô bệnh học theo Lauren khá đơn giản và đã được sử dụng
rộng rãi trên toàn thế giới. Hai thể mô học này có sự khác biệt rõ rệt về dịch
tễ, bệnh nguyên và đặc biệt là tiên lượng [4], [5], [6], [7]. Khác nhau về hình
thái được quy cho vai trò của các phân tử kết dính liên bào, chúng được bảo
toàn trong thể ruột và khiếm khuyết trong thể lan tỏa [32].


7

Nhiều nghiên cứu cho thấy tiên lượng UTDD thể ruột thường tốt hơn
UTDD thể lan tỏa. Theo Lazăr và cộng sự (2009), thời gian sống thêm của
các bệnh nhân UTDD thể lan tỏa trung bình là 11,3 tháng, thấp hơn đáng kể
so với UTDD thể ruột với thời gian sống thêm trung bình 20,4 tháng (p =
0,0415) [5].
 Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày theo tổ chức Y tế thế giới.
Bảng 1.1: Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dạ dày [1], [33], [34]
WHO (2010)
Lauren 1965
Ung thư biểu mô tuyến nhú
Ung thư biểu mô tuyến ống
Ung thư biểu mô tuyến nhày
Ung thư biểu mô tế bào nhẫn
Các ung thư biểu mô kém kết dính khác

nhóm I các tác nhân gây ung thư dạ dày-carcinoma (nhóm nguy cơ gây ung
thư cao nhất) ở người [38]. Có khá nhiều bằng chứng dịch tễ về mối liên quan
giữa nhiễm H. pylori với UTDD, đặc biệt là UTDD không thuộc tâm vị [39],
[40]. Nhiễm H. pylori làm tăng nguy cơ UTDD không thuộc tâm vị xấp xỉ 6
lần. Người ta cũng đã ước tính được rằng H. pylori liên quan đến khoảng 75%
các trường hợp UTDD không thuộc tâm vị, cả ở type ruột và type lan tỏa trên
toàn thế giới [39]. Nhiều cơ chế đã được mô tả cho quá trình sinh UTDD liên
quan với H. pylori, bao gồm viêm, sự tương tác trực tiếp với các cơ quan gây
ra sự mất ổn định về di truyền trong vật chủ, và những thay đổi biểu sinh liên
quan đến H. pylori [41].
 Chế độ ăn
- Muối và thức phẩm chứa muối
Trong số các yếu tố dinh dưỡng, lượng muối cao đã được chứng minh
liên kết với một nguy cơ UTDD, chủ yếu gắn với nhiễm H. pylori [42]. Chế độ
ăn uống có nhiều nitrate như các loại cá, thịt chế biến sẵn, các loại thức ăn xông
khói, ướp muối, sẽ làm tăng nguy cơ UTDD. Nitrosamin có trong thức ăn hoặc
do một số loại thức ăn chứa nitrate tạo ra là một chất gây UTDD [43], [44].
Các thức ăn giàu chất chống oxy hóa chẳng hạn như trái cây tươi và rau
quả giảm nguy cơ ung thư dạ dày. Đồng thời cũng cần nhấn mạnh rằng stress
oxy hóa và viêm mãn tính có thể là một cơ chế mà H. pylori gây ra UTDD [1].


9

- Rượu
Dựa trên cả nghiên cứu thực nghiệm và dịch tễ học, nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra tác hại của rượu lên sự phát triển của ung thư dạ dày.
Các nghiên cứu về rượu và ung thư dạ dày trên động vật đã không đi đến
kết luận rõ ràng. Nghiên cứu thực nghiệm trên loài gặm nhấm, 10% ethanol
trong ly nước uống không làm thúc đẩy sự phát triển của khối u dạ dày liên

Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ UTDD lên 1,56 lần [54]. Theo Gonzalez, xấp
xỉ 18% trường hợp UTDD được quy cho hút thuốc lá. Nguy cơ UTDD tăng
theo thời gian hút thuốc và giảm đi sau 10 năm cai thuốc [55].
Có một số cơ chế có thể dẫn đến mối liên quan giữa hút thuốc lá và ung
thư dạ dày. Các chất trong khói thuốc lá chứa một số chất gây ung thư đã
được chứng minh có liên quan đến ung thư biểu mô dạ dày ở người [56].
DNA Adducts (DNA cộng sinh) liên quan đến hút thuốc có thể liên kết với
DNA niêm mạc dạ dày đã được tìm thấy trong ung thư dạ dày của người hút
thuốc [57]. Hút thuốc lá làm gia tăng nguy cơ loạn sản và dị sản ruột - các tổn
thương tiền thân của ung thư dạ dày [58]. Các hợp chất N-nitroso có trong
khói thuốc lá và có thể có liên quan đến ung thư dạ dày [59].
Trong hầu hết các nghiên cứu thuần tập, sự liên quan của hút thuốc với
ung thư dạ dày là mạnh hơn ở nam giới so với phụ nữ [60]. Trong những
nghiên cứu trước đây, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nam giới được
chẩn đoán mắc ung thư dạ dày type ruột nhiều hơn, trong khi tỷ lệ phụ nữ lớn
hơn được chẩn đoán UTDD type lan tỏa [61]. Nếu có mối liên quan chặt chẽ
hơn với việc hút thuốc lá với type ruột, thì điều này có thể giải thích một số
khác biệt giữa nam giới và phụ nữ trong mối liên hệ giữa hút thuốc với ung
thư dạ dày. Nghiên cứu tiến cứu của Nomura AM và cộng sự trên 215.000
người cho thấy khả năng này, vì HR là 2,06 đối với ung thư type ruột và 1,18 đối
với ung thư thể lan tỏa. Trong hai nghiên cứu thuần tập ở Nhật Bản ở nam giới,
có một báo cáo có nguy cơ cao hút thuốc lá cho type ruột [62] trong khi nghiên


11

cứu khác không [63]. Rõ ràng, cần nhiều nghiên cứu hơn để xác định mối liên
quan giữa hút thuốc lá với các dạng mô học đặc trưng của ung thư dạ dày.
Trong một phân tích tổng hợp của 42 nghiên cứu thuần tập, các nguy cơ
liên quan đến giới tính ở những người đang hút thuốc là 1,62 ở nam giới (95%

Ngoài ra, có xu hướng đáng kể trong nguy cơ ung thư dạ dày với số năm hút
thuốc lá tăng lên ở cả nam và nữ.
Trong nghiên cứu của Nomura AM chỉ có 104 trường hợp ung thư tâm
vị, nhưng đã tìm ra mối liên hệ dương tính giữa những người từng hút thuốc
lá. Khi nam giới và phụ nữ được phân tích kết hợp, cả những người hút thuốc
lá hiện tại và trước đây đều có nguy cơ ung thư cao hơn đáng kể so với ung
thư dạ dày không ở tâm vị. Trong nghiên cứu EPIC, nguy cơ tương đối giữa
những người hút thuốc lá hiện nay là 4.10 (95% CI 1.76-9.57) đối với ung thư
thuộc tâm vị và 1.94 (95% CI 1.05-3.60) đối với ung thư dạ dày không thuộc
tâm vị [55]. Một số nghiên cứu bổ sung cũng cho thấy hút thuốc lá là một yếu
tố nguy cơ cao hơn đối với ung thư dạ dày tâm vị [62], [53], nhưng những
người khác lại không ủng hộ quan điểm này [63], [65]. Trong một phân tích tổng
hợp bao gồm 9 nghiên cứu thuần tập, nguy cơ tóm tắt tương đối giữa những
người hút thuốc lá hiện nay là 1.87 (95% CI 1.31-2.67) đối với ung thư tâm vị và
1.60 (95% CI 1.41-1.80) đối với ung thư dạ dày không phải thuộc tâm vị [60].
Một yếu tố góp phần vào sự thiếu thống nhất trong việc chỉ ra rằng hút thuốc có
thể liên quan chặt chẽ hơn với UTDD tâm vị hơn là với ung thư dạ dày không
thuộc tâm vị là phạm vi phân loại sai đối với ung thư tâm vị [62].
 Yếu tố liên quan đến vật chủ
- Yếu tố di truyền.
Nguy cơ của UTDD có liên quan với tính đa hình di truyền, chủ yếu bao
gồm các gen liên quan đến viêm (ví dụ, IL1B, IL1RN, IL10, và TNF) [42],
[66], [67]. Cả hai interleukin (IL) -1β và yếu tố hoại tử khối u (TNF) -α, là


13

cytokine tiền viêm mạnh mẽ có tác dụng ức chế tiết acid dạ dày- tạo điều kiện
cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhập. Alen IL1B-511 T được tìm thấy có mối liên
quan đến nguy cơ ung thư biểu mô tuyến dạ dày [67]. Trong khi đó, nhiều

của UTDD liên quan đến sự rối loạn điều hòa các con đường gây ung thư kinh
điển như p53 [73], WNT / β-catenin [74], NF-κB [75] và PI3K / Akt [76].
Trung tâm của các cơ chế này là những thay đổi di truyền và biểu sinh trong
các đường tín hiệu gây ung thư [1].
1.1.4. Chẩn đoán ung thư dạ dày.
Chẩn đoán ung thư dạ dày tùy thuộc vào giai đoạn tiến triển của bệnh.
Chẩn đoán lâm sàng giai đoạn muộn thường không khó, chẩn đoán khó hơn là
UTDD giai đoạn sớm vì triệu chứng thường không điển hình và chỉ có tính
chất gợi ý. Hiện nay có khá nhiều phương tiện và các phương pháp chẩn đoán
cận lâm sàng, mỗi phương pháp có một ưu nhược điểm khác nhau và nên kết
kết hợp các phương pháp trong tầm soát, chẩn đoán cũng và đánh giá bệnh
nhân để lựa chọn chỉ định và phương pháp điều trị.
1.1.4.1. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng lâm sàng của UTDD thường rất nghèo nàn và không đặc
hiệu nên dễ lầm tưởng với triệu chứng của các bệnh lý khác.
+ Các triệu chứng sớm và không đặc hiệu: Chán ăn, ăn không tiêu, gầy
sút nhanh, da xanh, mệt mỏi.
+ Các triệu chứng rõ rệt: Đau bụng, khối u bụng, thể trạng suy kiệt, di
căn hạch thượng đòn trái, khối u buồng trứng, di căn xương hoặc các biến
chứng như thủng dạ dày, xuất huyết tiêu hóa.