BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ ĐẤU
MSHV: 62031005

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH
KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE
PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

CẦN THƠ, 2015


Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường tại Đại
học Cần Thơ
Vào……giờ…….., ngày……tháng……..năm……….

Có thể tìm luận án tại: Thư viện Quốc gia
Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ


Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài

phân lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng
kháng sinh đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị
bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong khu vực.
1.2 Mục tiêu: Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các
chủng V. cholerae trên những mẫu phân lập được; xác định đặc tính kháng
1


kháng sinh của các chủng V. cholerae và các kiểu đột biến gene gây kháng
thuốc; đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng
đã công bố và tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng
vaccine đang lưu hành trên thị trường.
1.3 Ý nghĩa của luận án: Xác định các kháng sinh còn nhạy cảm với
Vibrio cholerae nhằm giúp cơ sở y tế chọn những loại kháng sinh điều trị
bệnh tả có hiệu quả trên người.
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi
khuẩn có đột biến để sản xuất vaccine phòng bệnh tả trên người; cung cấp
thông tin giúp cảnh báo về khả năng gây bệnh trên người của các chủng
Vibrio spp. trong các nguồn nước, nguồn thực phẩm có nguồn gốc thủy hải
sản tại tỉnh Trà Vinh.
1.4 Những điểm mới của luận án
Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Đồng bằng sông Cửu Long phân
lập được 6 chủng V. cholerae trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản và mẫu
từ môi trường nước sông và nước ao nuôi tôm; xác định được type huyết
thanh học của V. cholerae là Ogawa và Inaba; xác định được sự tương
đồng về trình tự nucleotide của các chủng V. cholerae phân lập được với
trình tự nucleotide của những chủng V. cholerae ở các nước thuộc vùng
Đông Nam Á; xác định được gene kháng tetracycline của V. cholerae phân
lập được.
Bố cục của luận án

định là V. cholerae O139 Bengal. Về mặt di truyền, O139 Bengal hình
thành từ type sinh học El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng
cũng biến đổi. Tất cả ở mọi lứa tuổi trên người (kể cả trong vùng đã có
dịch) đều có thể bị nhiễm, vi khuẩn V. cholerae O139 đã gây bệnh ít nhất
11 nước ở Đông Nam Á đến năm 2005 (Garg et al., 2003).
Ở Việt Nam bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra
tiêu chảy từ những năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả lại xảy ra
và đến năm 1910-1930 bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962).
Đến năm 1964 V. cholerae O1 type sinh học El Tor lại gây bệnh ở miền Nam
Việt Nam. Trong lịch sử, phần lớn các đợt dịch bệnh tả đều xuất hiện ở các
khu vực ven biển miền Trung và Nam Việt Nam. V. cholerae O1 type sinh
học El Tor hiếm khi xuất hiện ở Bắc Việt Nam. Đến năm 1976, bệnh có xảy
ra tại thành phố Hải Phòng và tỉnh Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1999). Từ
năm 2007 đến năm 2008 và năm 2010, một chủng vi khuẩn V. cholerae
O139 được phân lập từ 7 mẫu nước và được đặt tên là V. cholerae O139.
Tuy có sự lây lan nhanh chóng của O139 trong khu vực Đông Nam Á
nhưng ở Việt Nam, có rất ít thông tin về bệnh tả do O139 gây ra (Dong Tu
Nguyen, 2012).
2.2 Phân loại – Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae
2.2.1 Phân loại vi khuẩn V. cholerae
V. cholerae là vi khuẩn Gram âm gây bệnh tả ở người, thuộc chi Vibrio
lớp Gammaproteobacteria. V. cholerae có hai type sinh học chính, đó là
type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor, và một số nhóm type huyết
thanh khác. V. cholerae được phân loại căn cứ trên kháng nguyên O ở
3


phần thân và các nhóm huyết thanh, đến nay người ta đã biết có ít nhất 200
nhóm huyết thanh (Kaper et al., 1995). Trước năm 1992, nhóm O1 là
nhóm huyết thanh duy nhất gây ra dịch, từ năm 1992 về sau một nhóm

đóng vai trò thụ thể cho phage CTXΦ để cho phage chui vào vi khuẩn, và
gắn DNA của nó vào nhiễm sắc thể của V. cholerae theo cơ chế phage
tiềm tan (lysogenic).
Bản chất của các gene CTX và TCP đều là bacteriophage từ bên ngoài
được gắn vào trong nhiễm sắc thể của V. cholerae. V. cholerae vốn là vi
khuẩn “hiền” nhưng khi bị các bacteriophage gây nhiễm chúng mới trở
thành chủng sinh độc tố và gây bệnh lý. V. cholerae trở thành chủng sinh
độc tố (toxicogenic V. cholerae) và gây bệnh khi chúng có tiêm mao giúp
vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non.

Hình 2.2: Sự hình thành chủng V.cholerae có độc tố (Blake, 1994)

2.2.4 Các yếu tố về độc lực
V. cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiêm mao/roi (TCP)
và độc tố tả CTX. TCP, mã hóa cho các yếu tố gây bệnh, là một loại
protein từ tiêm mao (Kirn et al, 2000), TCP cũng rất cần thiết cho sự hình
thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị trong ruột non của chuột sơ sinh
(Taylor et al., 1987) và con người (Herrington et al., 1988). Khi sự hình
thành khuẩn lạc trong ruột non thành công, V. cholerae sẽ tiết ra độc tố gây
bệnh tả. Các độc tố kích thích các tế bào biểu mô ruột non tiết ra dịch lỏng
trong lòng ruột non, từ đó có hiện tượng tiêu chảy mất nước. Do đó, sự đột
biến ở roi của một số chủng V. cholerae sẽ ảnh hưởng đến yếu tố độc lực
TCP, Hình sau biểu hiện sự biến đổi về roi.

5


a. Roi dài

b. Không có roi


3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1.1 Hoá chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Nước cất, nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), thuốc thử Kowacs, cồn 96o,
cồn 70o, muối tinh khiết, alkaline saline peptone water (ASPW) với các
nồng độ từ 0-10%. Môi trường chuyên chở mẫu bệnh phẩm: Cary- Blair
(India); môi trường nuôi cấy: TCBS: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muốiSacaroza (Merck); SNA: Saline Nutrient Agar (Merck); môi trường làm
kháng sinh đồ: MHA (Muller Hinton Agar), đĩa giấy tẩm kháng sinh (Nam
Khoa, Tp. HCM).
Môi trường và hóa chất dùng phân lập vi khuẩn: đĩa giấy oxidase, đĩa
giấy ONPG, TSI agar (Saline triple sugar iron agar), ADH (Arginine
Dihydrolase), Tryptophan saline (Bộ định danh vi khuẩn Gram âm: IDS
14GNR, Nam Khoa, Tp.HCM). 8 loại đĩa kháng sinh sử dụng:
streptomycin (10μg), norfloxacin (10μg), ampicillin (10μg), tetracycline
(30μg), azithromycin (30μg), amoxicillin-clavulanic axit (30μg),
trimethoprim-sulfamethoxazole (25μg) và vancomycin (30μg); bộ thuốc
nhuộm Gram: dung dịch crystal violet; lugol; cồn - aceton; safranin
(Germany); kháng huyết thanh định type V. cholerae: Inaba, Ogawa và
O139; (Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh).
3.2.1.2 Hoá chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR
Xác định vi khuẩn dựa trên đoạn gene 16S rDNA
Bảng 3.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa
trên gene 16S rDNA.
Mồi

Trình tự nucleotide của mồi (5'3')

27F


Xác định gene kháng kháng sinh
7


Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer,
MgCl2, dNTPS, DMSO, Taq polymerase và các cặp mồi xác định gene
kháng kháng sinh.
Bảng 3.2: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR xác
định gene kháng kháng sinh.
Nhóm
kháng sinh
β-Lactam

Aminoglycosid

Gene
được
kiểm tra
blaSHV
aac(3)IV

Tetracycline

tetA

Trimethoprim

dhfrI

Trình tự nucleotide của mồi

trắng giống New Zealand, trọng lượng 2-2,5kg/con.
3.2.1.4 Thiết bị - Dụng cụ
Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, autoclave, máy lắc, buồng cấy vô trùng và kính
hiển vi, cân điện tử, ống nghiệm, đĩa petri, chai, ống đong, ống hút, lam,
kẹp, kéo, tăm bông vô trùng, găng tay, đèn cồn, túi nilon.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn
* Phương pháp lấy mẫu
8


Mẫu nghêu: nghêu được thu mua tại các chợ huyện Duyên Hải và Cầu
Ngang, nghêu còn tươi (25gram/con), rửa sạch chất bẩn bên ngoài, lấy
phần thịt cắt nhuyễn (1gram) tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW.
Mẫu huyết heo: được thu từ các cơ sở giết mổ thuộc Thành phố Trà
Vinh và các huyện: Châu Thành, Duyên Hải, Cầu Ngang và Càng Long, ở
mỗi cơ sở đều lấy 25 ml mẫu/lần có pha nước muối với tỉ lệ 0,5%, mẫu
được chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó hút l ml mẫu đem tăng sinh
trong 9 ml môi trường ASPW .
Mẫu nước: được thu trên bề mặt nước tại các ao nuôi tôm, nước sông,
nước biển (mỗi loại 25 ml mẫu), sau đó lấy 1ml nước tăng sinh trong 9ml
môi trường ASPW.
Mẫu tôm: được thu từ huyện Duyên Hải, tôm còn tươi (150gram/con)
tôm được rửa sạch lấy phần đầu, cắt nhuyễn 1gram mẫu, lọc lấy dịch trong
và tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW.
Mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy: dùng tăm bông vô trùng lấy phân
của bệnh nhân tiêu chảy, bảo quản ở môi trường vận chuyển Carry-Blair,
và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập.
* Phương pháp nuôi cấy
Các loại mẫu đều được nuôi tích lũy 2 lần trong môi trường ASPW. 1

Việc định type huyết thanh của V. cholerae được thực hiện bằng phản
ứng ngưng kết với 4 loại kháng huyết thanh Inaba, Ogawa, O139 và kháng
huyết thanh đa giá Inaba + Ogawa + O139 (Trần Linh Thước, 2009)
d. Xác định vi khuẩn Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR
Các gốc vi khuẩn thuần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, dựa trên
gene 16S rRNA. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5%
trong dung dịch đệm TBE 1X ở điện thế 100V trong 90 phút và chụp bằng
máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty
Fermentas).
3.2.2.2 Phân tích trình tự gene 16S RNAvà thiết lập cây di truyền.
Sản phẩm PCR (DNA) ký hiệu 6 trình tự của 6 chủng thuộc Vibrios: V.
cholerae-Ng3, V. cholerae-O3.2, V. cholerae-O1.2, V. cholerae-81V1, V.
cholerae-N8 và V. cholerae-85V1, được giải trình tự tại công ty Macrogen
Inc (Hàn Quốc). Các trình tự được phân tích và đọc bằng phần mềm
Bio.Edit, sau đó so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên
Genbank và thiết lập cây di truyền.
3.2.2.3 Xác định sự kháng kháng sinh của vi khuẩn V. cholerae
a. Xác định sự kháng kháng sinh bằng PP Kirby Bauer
* Chọn 08 loại kháng sinh thường được sử dụng để điều trị bệnh ở
đường ruột, đặc biệt là bệnh tả.
Sau khi ủ 18 đến 24 giờ, đo đường kính vùng ức chế, kể cả đường kính
khoanh giấy kháng sinh và đọc kết quả dựa vào bảng tiêu chuẩn đánh giá sự
nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn đường ruột (CLSI, 2010).
b. Xác định sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng kỹ thuật
PCR (Polymerase Chain Reaction)
10


Sau khi ly trích DNA, tiếp tục xác định gene kháng kháng sinh
bằng kỹ thuật PCR với các trình tự cặp mồi tương ứng với gene kháng

chất lỏng theo dãy thập phân (log 10). Kết quả được tính theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x D1/v (Mi: số lượng vi khuẩn trong dung dịch ban
đầu; Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa; D1: độ pha loãng; v: dung tích huyền
dịch /đĩa). Chuẩn bị các chuỗi pha loãng:
11


(iii) Tỉ lệ vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột non thỏ
Phần trăm (%) bám dính = 100 x số vi khuẩn bề mặt ruột/ số vi khuẩn
bề mặt ruột + CFU dịch lỏng (Richardson, 1991).
Xử lý số liệu: Phần mềm Excel: tính các giá trị trung bình về tỉ lệ
nhiễm V.cholerae và tỉ lệ kháng kháng sinh; phần mềm BioEdit: phân tích
kết quả giải trình tự nucleotide; phần mềm MEGA (Treeview): vẽ cây giản
đồ phả hệ; Minitab version 16.0: phân tích các giá trị FA và CFU.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và định danh Vibrio spp.
4.1.1 Kết quả phân lập Vibrio spp.
Vi khuẩn Vibrio spp. có thể phát triển trong môi trường thạch
muối-sucrose thiosulfate citrate-mật (TCBS): khuẩn lạc màu vàng
hoặc màu xanh tuỳ loài. Nhìn chung khuẩn lạc thuộc các loài V.cholerae,
V. vulnificus; V. fluvialis và V. alginolyticus đều có màu vàng, riêng khuẩn
lạc V. paraheamolyticus có màu xanh; kích thước khuẩn lạc của từng loài
cũng khác nhau (Trần Linh Thước, 2009).
4.1.2 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa
Quan sát đặc tính sinh hóa để phân biệt giữa các loài thuộc
Vibrio spp. Hầu hết đều tạo sản phẩm oxidase và catalase, lên men
đường và không sinh hơi; V. cholerae, V. paraheamolyticus, V.
fluvialis và V. alginolyticus đều không lên men đường lactose, riêng V.
cholerae và V. alginolyticus có khả năng oxy hóa tryptophan của vi
khuẩn thành những sản phẩm biến dưỡng có gốc indole gồm indole,


TSI

V.alginolyticus
Vàng
(+)
(+)

Glucose

(+)

(+)

(+)

Lactose

(-)

(-)

(+)

(-)

(-)

Sucrose


(+)

(+)

ONPG

(+)

(+)

(+)

(+)

Indole

(+)

(-)

(-)

(-)

(+)

Urease

(-)


Hình dạng vi khuẩn V. cholerae dưới kính hiển điện tử với độ phóng
đại 5.000 và 10.000:

Hình 4.1: Vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử, độ phóng đại 5.000 và
10.000 lần
Hình ảnh vi khuẩn V. cholerae chủng O3.2 qua kính hiển vi điện tử có
hình hơi cong, có chiều dài từ 1 µm – 3 µm, có roi ngắn. V. cholerae sử
dụng hai yếu tố độc lực từ tiêm mao/pili (TCP) và độc tố dịch tả CTX.
13


TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị
trong ruột non của chuột sơ sinh (Taylor et al., 1987) và con người
(Herrington et al., 1988).
Vi khuẩn trong nghiên cứu này có roi ngắn, điều đó có thể do sự khiếm
khuyết trong việc lắp ráp roi và có hiện diện của gene đột biến nên chiều
dài roi không nhìn thấy qua kính hiển vi điện tử.
4.1.3 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR

Hình 4.2: Sản phẩm khuếch đại đoạn gene 16S-27F và 1492Rbp
Kết quả điện di hình trên cho thấy các sản phẩm PCR dài 1500 bp
tương đương với đoạn gene 16S rRNA ở tất cả các chủng thuộc Vibrio
spp. dài 1.500 bp (William et al., 1991) bao gồm các khu vực bảo tồn cao
và có mặt ở hầu hết các vi khuẩn có phân nhánh nhưng có mối quan hệ
gần. Đối chiếu các kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa với các sản phẩm từ
PCR, nghiên cứu ghi nhận những loài thuộc Vibrio lần lượt: V. cholerae
vạch từ 1-6; V. fluvialis từ 7-11; V. paraheamolyticus từ 12-19; V.
vulnificus từ 20-23; V. alginolyticus từ 24-25. Cũng qua nghiên cứu này,
chưa phát hiện được chủng nào thuộc Vibrios mang gene O139rfb và
chủng mang gene mã hoá độc tố CTXA trên những mẫu từ môi trường


Số mẫu kiểm
tra

Dương tính
Số mẫu Tỉ lệ (%)

V. cholerae

160

03

1,9

V. paraheamolyticus

160

03

1,9

V. vulniticus

160

04

2,5


2,0

Nước (n = 150)
+ Nước sông

V. cholerae

50

01

2,0

+ Nước biển

V. alginolyticus

50

01

2,0

+ Nước ao nuôi tôm

V. paraheamolyticus

50


là cao nhất (32%), chúng xuất hiện trên nghêu, trong nước sông, đặc
15


biệt ở nước ao nuôi tôm có độ mặn từ 6 - 8% và trên tôm, phù hợp với
môi trường sống của chúng. Nghêu cũng là ký chủ thường xuyên của
V. vulniticus; V. fluvialis và V. alginolyticus.
4.2 Kết quả định type huyết thanh
Kết quả định type huyết thanh học các chủng Vibrio cholerae phân lập
được bằng phản ứng ngưng kết cho thấy 100% (6/6) chủng dương tính với
kháng huyết thanh đa giá (Ogawa, Inaba, O139), trong đó 50% (3/6) chủng
thuộc Ogawa và 50% (3/6) chủng thuộc Inaba.
4.3 Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên
Genbank bằng công cụ BLAST
Trong nghiên cứu này, những chủng đại diện thuộc loài Vibrio spp.
phân lập được gồm chủng Ng3, O3.2, O1.2, N8 và O9.1 có tỉ lệ tương
đồng về trình tự nucleotide đoạn gene 16S-27F và 1492R của các chủng
phân tích với các chủng khác thuộc loài V. cholerae là rất cao.

Hình 4.3: Cây biễu diễn mối quan hệ di truyền dựa trên 16srDNA của các
Vibrio spp. phân lập và một số chủng tham khảo

Hình trên cho thấy những chủng vi khuẩn phân lập có những đặc điểm
tương tự như những chủng có nguồn gốc từ môi trường, chứng tỏ những
16


chủng thuộc Vibrio spp. luôn có nguy cơ tiềm ẩn và sẽ dễ dàng gây thành
dịch bệnh do tiếp nhận các gene từ các chủng có độc lực CTX.
4.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae


Kháng
Số mẫu

%

6
6
6
6
6
6

3
6
5
4
4
5

50
10 0
83
67
67
83

3
0
1


Các kết quả trên cho thấy, các chủng V. cholerae trong nghiên cứu này
còn nhạy cảm cao với nhiều loại kháng sinh như norfloxacin (100%),
ampicillin (83%) và amoxicillin-clavulanic acid (83%). Ngoài ra, V.
cholerae kháng với vancomycin (67%), streptomycin 50%, tetracycline
33%....Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân
Trang và Nguyễn Ngọc Tuân (2012); Huu Dat Tran (2012).
4.4. Sự hiện diện một số gene kháng kháng sinh ở các vi khuẩn
phân lập bằng kỹ thuật PCR
M

1 2

tetA (880bp)

900bp

M: thang chuẩn 100bp, 1: V.cholerae (T1), 2: V.cholerae (T3)
Hình 4.4: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF và testAR

17


Kết quả điện di hình trên, cho thấy các sản phẩm PCR dài khoảng
880bp tương ứng với đoạn gene tetA được phát hiện ở 2 chủng V.
cholerae. Gene tetA có trình tự bảo tồn đặc trưng cho V. cholerae nên các
sản phẩm PCR quan sát được đều thuộc chủng V. cholerae T1 và T2. Qua
nghiên cứu, chưa phát hiện chủng V. cholerae mang gene kháng kháng
sinh blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI. Chủng V. cholerae (T1) và chủng V.
cholerae (T3) đều phân lập từ môi trường nước và chúng đều mang gene

Nucleotide
AGT→CTG
CCT→TGA
TGG→TCA
CGT→TAG
GTT→TAA
A-T→TCA
CA - →CG - TG→-TG GCT→TAG
GGT→TGA
AAA→TGA
GTA→TGA
CTT→TGA
GAA→TGA
TCA→TGA

Thay đổi
acid amin
Ser→Leu
Pro →End
Trp→Ser
Arg→End
Val→End
→ Ser
→
→
Ala→End
Gly →End
Gly →End
Val →End
Leu →End



Khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae hoang dại N16961
với các vị trí nucleotide chủng V. cholerae T1 phân lập được, nhận thấy
chủng V. cholerae T1 có hiện tượng đột biến là thêm hoặc mất từ 1- 3
nucleotide ở nhiều codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí các acid amin
và thay đổi cấu trúc protein. Chủng V. cholerae T1 có codon kết thúc ở 10
vị trí, tương ứng với 10 vị trí acid amin, đây là một đột biến dịch khung do
thêm vào hoặc bớt đi một đến hai nucleotide, dẫn tới 1 stop codon (end)
điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid và các enzyme này sẽ bị
ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).
Bảng 4.5: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại
N16961 với chủng V. cholerae T3
Codon

6
14
17
19
23
24
32
48
52
53
54
55
63
71
74


Số
nucleotide
T3 mất

Kiểu đột
biến

End →End
Ser→Leu
End→Ile
Thr→Pro
Asp→Leu
Ser→Tyr
Asn→Met
Thr→Ala
Trp→Leu
Asp→Gly
Leu→Gly
Lys→Tyr
Gly→Glu
Val→Glu
→
Lys →End
Ile→End
Glu→End
Ala→End
Val→End

Thêm đoạn

Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung

Tương tự với T1, khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae
hoang dại N16961 với các vị trí nucleotide chủng V. cholerae T3 phân lập
được, nhận thấy chủng V. cholerae T3 cũng có hiện tượng đột biến là thêm
19


hoặc mất từ 1- 3 nucleotide ở mỗi codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí
các acid amin và thay đổi cấu trúc protein. Chủng V. cholerae T3 có codon
kết thúc ở 6 vị trí, tương ứng với 6 vị trí acid amin, đây là một đột biến
dịch khung do thêm vào hoặc bớt đi một đến hai nucleotide, dẫn tới 1 stop
codon (end) điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid và các
enzyme này sẽ bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
4.4.6 Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng
kháng sinh tetA
Trong nghiên cứu này, 2 chủng V. cholerae phân lập tại Trà Vinh có
mang gene mã hoá gene kháng kháng sinh tetracycline phân lập trên mẫu
nước và mẫu nghêu có tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide với các
chủng khác ở Thái Lan, Nhật Bản, Trung quốc, Indonesia, Brazil và Ấn
Độ, tương đồng 97% với 10 chủng; tương đồng 96% với 01 chủng và
tương đồng 94% với 04 chủng khác.

Hình 4.5: Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng kháng
sinh tetA


lỏng, chỉ tiết ra từ 0.8 – 0.9 ml/cm tại thời điểm 6 giờ, sau đó giảm dần chỉ
còn 0.15 - 0.2 ml/cm ở thời điểm 16 giờ. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống
kê (p
cũng giảm xuống đáng kể ở thời điểm 9 giờ chỉ còn 12,103 đến 20,103, đến
thời điểm 16 giờ hầu như tất cả các chủng đều không còn bám dính vào
niêm mạc ruột non, chứng tỏ V. cholerae bị ức chế bởi các kháng thể được
tiết ra từ niêm mạc ruột non.
Vậy, đối với tất cả thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả đã có kháng thể
nên hàm lượng vi khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ, sau đó
không còn bám dính vào niêm mạc ruột non ở thời điểm 16 giờ, đặc biệt 2
chủng T1và T3 có hàm lượng vi khuẩn ít nhất so với các chủng khác.
23