BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CHU NGỌC PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY
CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢO
DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15
DƯỚI ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ

Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung

TPHCM – 2018


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là báo cáo khóa luận của riêng em. Các thơng tin, số
liệu sử dụng phân tích và kết quả nghiên cứu được nêu trong khóa luận là trung
thực, khách quan, có nguồn gốc rõ ràng, hồn tồn được hình thành và phát triển
trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của em tại Bộ mơn Hóa sinh – Độc chất
trường Đại học Nguyễn Tất Thành, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Võ Hồng
Trung. Các luận điểm, dữ liệu được trích dẫn đầy đủ nếu không là ý tưởng hoặc kết
quả tổng hợp của chính bản thân em.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 10 năm 2018
Sinh viên ký tên

CHU NGỌC PHƯỢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Tổng quan về Dunaliella.................................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu vi tảo Dunaliella ...................................................................... 3
1.1.2. Hình dạng và cấu trúc tế bào Dunaliella .................................................. 3
1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học ở Dunaliella ............................................. 4
1.1.4. Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ở Dunaliella ......................................... 6
1.1.5. Các điều kiện ức chế ảnh hưởng lên sự tổng hợp carotenoid ................. 10
1.1.6. Mối quan hệ giữa con đường tổng hợp carotenoid và lipid .................... 16
1.2. β-carotene và vai trò đối với sức khỏe ........................................................... 19
1.2.1. Giới thiệu β-carotene............................................................................... 19
1.2.2. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe ................................................. 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................22
2.1. Chủng Dunaliella bardawil DCCBC 15 và môi trường nuôi cấy ................. 22
2.2. Phương pháp phân tích ................................................................................... 22
2.2.1. Quan sát hình thái tế bào ......................................................................... 22
2.2.2. Xác định mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu.......................... 22
2.2.3. Xác định hàm lượng carotene tổng và diệp lục tố .................................. 23
2.2.4. Xác định khả năng chống oxy hóa .......................................................... 23
2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng ......................................................... 24
2.2.6. Xác định trọng lượng khô ....................................................................... 24
2.2.7. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp sulfo-phospho-vanillin ... 24
2.2.8. Thu hoạch sinh khối tảo phân tích β-carotene ........................................ 25

i


2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm ................................................................... 25
2.3.1. Khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15
trong môi trường MD4 1,5M NaCl ................................................................... 25


Micromol/lít

AS

Ánh sáng

g/l

Gram/lít

M

Mol/lít

NPK

Nitơ – Phosphor – Kali

pg/tb

Picogram/tế bào

ROS

Reactive oxygen species

Gốc tự do oxy hóa

tb/mL

ức chế khác nhau ......................................................................................................36
Hình 3.7. Mật độ tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi
cấy ức chế khác nhau ...............................................................................................37
Hình 3.8. Tro ̣ng lươ ̣ng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n
ni cấy ức chế khác nhau .......................................................................................37
Hình 3.9. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo
D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................40
Hình 3.10. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo
D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................41

iv


Hình 3.11. Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ
carotenenoid/diệp lục tố (c) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n
ni cấy ức chế khác nhau .......................................................................................44
Hình 3.12. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều
kiện ni cấy ức chế khác nhau ...............................................................................47
Hình 3.13. Hàm lượng lipid trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil
DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n ni cấy ức chế khác nhau .....................................48
Hình 3.14. Hàm lượng phenolic trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo
D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n ni cấy ức chế khác nhau ..................50
Hình 3.15. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo
D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................52

v


DANH MỤC BẢNG


DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .....................................51
Bảng 3.14. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích và trên tế bào của vi tảo
D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................53

vii


Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CÁC CHẤT CHỐNG
OXY HĨA CỦA VI TẢO DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 DƯỚI ẢNH
HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ
Chu Ngọc Phượng
Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung
TÓM TẮT
Mở đầ u: Nhu cầu sử dụng β-carotene trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung cấp
chủ yếu là từ tổng hợp hóa học do đó Dunaliella bardawil DCCBC 15 được xem là nguồn
sản xuất β-carotene tự nhiên tốt và có khả năng đáp ứng cao vì chứa các hợp chất có ứng
dụng quan trọng trong dược phẩm như β-carotene, glycerol và các chất màu khác.
Đố i tươ ̣ng và phương pháp nghiên cứu: Chủng tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15
được sử dụng để khảo sát sự tăng trưởng trong môi trường MD4 1,5M NaCl và ảnh hưởng
của ức chế H2O2 riêng rẽ và H2O2 kết hợp với ánh sáng cao, độ muối cao lên sự tăng
trưởng, tích lũy các chất chống oxy hóa, đặc biệt là hàm lượng β-carotene tích lũy trong vi
tảo.
Kế t quả: Dunaliella bardawil DCCBC 15 tăng trưởng tốt trong môi trường MD4 1,5M
NaCl, hàm lượng diệp lục tố tăng cao trong phase tăng trưởng, hàm lượng carotenoid tăng
mạnh khi vi tảo đạt phase ổn định hoặc suy vong do cạn kiệt dinh dưỡng. Trong các điều
kiện ức chế, sự tăng trưởng của Dunaliella bardawil DCCBC 15 bị ức chế, hàm lượng diệp
lục tố duy trì ổn định, trong khi đó tăng tổng hợp lipid và các chất chống oxy hóa như
carotenoid và phenolic. Trong đó ở điều kiện ức chế cạn kiệt dinh dưỡng và kết hợp với
cường đô ̣ chiế u sáng ma ̣nh thì hàm lượng β-carotene cao hơn so với các điều kiện còn lại.

level at stationary phase or death phase due to nutrient starvation of cultural medium.
Under stress conditions, the growth of Dunaliella bardawil DCCBC 15 was inhibited and
stable chlorophyll content while the biosynthesis of lipid and antioxidants such as
carotenoids and phenolic increased. Under the stress conditions, the nutrient starvation and
combination of high light intensity, the content of β-carotene is higher than the other stress
conditions.
Conclusion: Dunaliella bardawil DCCBC 15 is a unicellular green microalgae, be able to
accumulate large amount of β-carotene and antioxidants under stress conditions such as
nutrition starvation and high light intensity. Therefore, the β-carotene production from the
microalgae is one of the studied prospects in future, expecially Viet Nam has long
coastline.
Keywords: Dunaliella bardawil DCCBC 15, MD4 medium, β-carotene, antioxidant
capacity.

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
Carotenoid được biết đến như là chất chống oxy hóa mạnh có nguồn gốc tự
nhiên giúp ngăn cản các tế bào bình thường chuyển thành các tế bào gây ung thư,
làm chậm lại sự phát triển của khối u, ngăn cản sự tạo thành các chất gây ung thư.
Ngồi ra, carotenoid cịn đóng vai trị quan trọng trong việc ngăn ngừa và điều trị
các bệnh như tim mạch, viêm thấp khớp, chứng loạn dưỡng cơ, bệnh đục thủy tinh
thể và một số rối loạn về thần kinh.
β-carotene là đồng phân quan trọng của carotenoid, thuộc nhóm các sắc tố
hữu cơ tự nhiên. β-carotene có thể chuyển hóa thành vitamin A trong cơ thể và
được xem là tiền chất tốt nhất của vitamin A trong các loại carotenoid. Nhiều
nghiên cứu đã cho thấy rằng β-carotene là một sắc tố tự nhiên có khả năng chống
oxy hóa rất cao, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với các chất chống oxy hoá
khác như vitamin C và vitamin E làm giảm các nguy cơ nhiễm trùng, làm chậm quá

- Khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi
trường MD4 và sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các
điều kiện ức chế.
- Xác định hàm lượng carotenoid tổng, khả năng chống oxy hóa, hàm lượng
phenolic tổng, hàm lượng lipid, diệp lục tố và trọng lượng khô của vi tảo.
- Xác định hàm lượng β-carotene tích lũy trong vi tảo.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Dunaliella
1.1.1. Giới thiệu vi tảo Dunaliella
Vi tảo là một cấu thành quan trọng của sinh vật phù du (plankton), đóng vai trị
quan trọng trong việc duy trì và phát triển hệ sinh thái dưới nước. Vi tảo là thức ăn
tươi sống đặc biệt quan trọng cho sự phát triển ấu trùng của hầu hết các lồi tơm, cá,
ốc và cho các động vật phù du; tính ưu việt của vi tảo là không gây ô nhiễm môi
trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt là chúng chứa
rất nhiều loại acid béo khơng no. Chúng có giá trị dinh dưỡng rất cao và phạm vi
ứng dụng rộng rãi [2].
Dunaliella là nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục - Họ
Dunaliellaceae. Các loài Dunaliella hiện diện trong các môi trường nước biển, các
hồ muối trên khắp thế giới và có khả năng chống chịu với các độ muối khác nhau.
Loài tảo này chẳng những xuất hiện ở Châu Phi, Đại Tây Dương và Địa Trung Hải,
mà cịn có mặt ở Biển Chết, các đại dương, biển, hồ khác - những nơi nước rất mặn,
có ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng chúng có khả
năng thay đổi hình dạng và thể tích để đáp ứng với sự thay đổi áp suất thẩm thấu
ngoại bào. Đây là sinh vật hiếm hoi có thể sinh tồn trong môi trường nước rất mặn,
nhờ chứa nồng độ cao carotenoid bảo vệ chúng khỏi ánh sáng và chứa lượng
glycerol cao giúp chúng giữ độ ẩm. Ngoài ra, chúng cũng rất giàu vitamin C và E

Spirulina, Haematococcus và Chaetoceros. Nhóm hợp chất chống oxy hóa chính
và được biết đến nhiều từ vi tảo là carotenoid. Carotenoid đóng một vai trò quan
trọng trong việc dập tắt các gốc tự do (ROS) tạo ra trong quá trình quang hợp, đặc
biệt là oxy singlet. Ngoài ra, các hợp chất phenolic cũng là chất chống oxy hóa
quan trọng ở vi tảo. Hàm lượng các hợp chất phenolic trong sinh khối tảo tăng khi
tiếp xúc với các điều kiện ức chế khác nhau (như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối, cạn
kiệt dinh dưỡng...) cho thấy chúng thật sự đóng một vai trị quan trọng trong đáp
ứng với các ức chế này [3], [23].
Dunaliella là một trong những lồi tảo lục chịu mặn có thể sản xuất và tích lũy
ba sản phẩm có giá trị cao về thương mại là glycerol, β-carotene và acid béo [8].
D.salina được nuôi cấy trong điều kiện ức chế khác nhau tăng sản xuất carotene
và dịch trích chứa carotene này có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và
chống ung thư cao [60].
Milko (1963) đã đề cập đến khả năng tạo ra lượng lớn β-carotene ở Dunaliella
sp. Sau đó, nhiều nhà khoa học như Ben-Amotz và Avron (1983), Borowitzka
(1988) đã chứng minh Dunaliella sinh ra nhiều β-carotene để làm chất bảo vệ cho
bộ máy quang hợp dưới các điều kiện môi trường bất lợi. Các yếu tố môi trường
như cường độ ánh sáng cao, điều kiện dinh dưỡng giới hạn, nồng độ muối cao và
nhiệt độ cao đều tác động đến các quang thụ quan cảm nhận ánh sáng hay kênh vận
chuyển, làm giảm tính ổn định của chúng, qua đó làm tăng các stress oxy hóa và
nồng độ oxy đơn bội. Các stress này có thể làm cho sự tăng trưởng của Dunaliella
bị giảm nhưng lại tăng cường sự tích lũy carotenoid. Từ đó, các nhà khoa học nhận
thấy Dunaliella chính là nguồn nguyên liệu chứa β-carotene tự nhiên tốt nhất với
các đồng phân 9-cis (chiếm 41%), all-trans (42%), 15-cis (10%) và đồng phân khác
(7%). Chính vì vậy, từ đầu những năm 1960, người ta đã bắt đầu sản xuất
Dunaliella để thu β-carotene tự nhiên và đến cuối những năm 1980, việc nuôi trồng
D.salina trên quy mô công nghiệp cũng đã bắt đầu được triển khai tại Australia,
Israel, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Kuwait, Iran...
5



6


đó là sự tạo vịng, sự khử hydro và sự oxy hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt
thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự
chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác
nhau.
Một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp như isoprenoid hay terpenoid gồm
một vài hợp chất có giá trị sinh học và kinh tế như carotenoid. Ở các sinh vật quang
hợp, isoprenoid được tổng hợp từ isopentyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl
diphosphate (DMAPP) từ con đường mevalonate trong tế bào chất (MVA) hoặc
con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) trong lục lạp (con đường
không MVA hoặc 1-desoxy-D-xylulose-5-phosphate [DXP]). Ở tảo lục chỉ có con
đường MEP trong lục lạp cung cấp các tiền chất cho sinh tổng hợp tất cả isoprenoid

[3], [54].
Ở tảo lục (Chlorophyta) (như D.bardawil DCCBC 15) dường như thiếu con
đường MVA trong tế bào chất. Ngược với con đường MVA trong tế bào chất cần 3
phân tử acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) để tạo IPP, con đường MEP sử dụng
pyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate làm cơ chất và 8 enzyme nằm trong lục
lạp sử dụng các cofactor và ion kim loại khác nhau (hình 1.2) [54].

7


Hình 1.2. Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảo Dunaliella salina [54]

GA-3P, glyceraldehyde-3-phosphate; DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate
synthase; DXR, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase; MCT, 2-Cmethyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferrase; CMK, 4-(cytidine 5’diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase; MDS, 2-C-methyl-D-erythritol 2,4cyclodiphosphate synthase; HDS, 4-hydroxy 3-methylbut-2-enyl diphosphate

đường MEP hoạt động trong D.salina để cung cấp các tiền chất IPP và DMAPP
cho sinh tổng hợp isopren, sự liên kết này cần thiết để cân bằng nhu cầu biến dưỡng
giữa các phần khác nhau của tế bào. Hơn nữa sự liên kết này cần thiết không chỉ
giữa tế bào chất và lục lạp mà còn giữa con đường biến dưỡng isopren và lipid khi
carotenoid thứ cấp ở D.salina được cô lập trong các hạt lipid trong lục lạp, trong
khi triglyceride được dự trữ trong các thể dầu trong tế bào chất [19], [54].
1.1.5. Các điều kiện ức chế ảnh hưởng lên sự tổng hợp carotenoid
Dưới những điều kiện ức chế như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối cao và cạn kiệt
dinh dưỡng, một số chủng Dunaliella có khả năng tích lũy trên 10% β-carotene

10


(all-trans và 9-cis β-carotene) so với trọng lượng khô của tế bào [12], [34]. D.salina
được cho là nguồn cung cấp β-carotene tự nhiên cao nhất trong hầu hết các sinh vật
quang hợp [15]. Beta-carotene là tiền vitamin A được ứng dụng nhiều trong thực
phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm [15], [21].
Dinh dưỡng
Nitrogen (N) là một trong những nguyên tố thiết yếu trong môi trường đối với
sự tăng trưởng của bất kỳ tế bào nào. Điều kiện thiếu hoặc hạn chế nitrogen được
xem như là ức chế đối với sinh vật. Sự hiện diện của nitrogen có ảnh hưởng đến sự
tích lũy carotenoid ở một số vi tảo. Trong điều kiện giới hạn của nitrogen làm tăng
hàm lượng β-carotene ở Dunaliella và astaxanthin ở Haematococcus. Mặt khác,
nồng độ nitrogen cao thích hợp cho sự tích lũy lutein ở Muriellopsis sp. [20].
D.salina ngừng tăng trưởng hàm lượng diệp lục tố giảm (do phân tử diệp lục tố
chứa 4 nguyên tử nitrogen trong cấu trúc) khi nitrogen không được cung cấp vào
môi trường, hàm lượng β-carotene tăng gấp 4 lần so với bình thường. Sự tăng hàm
lượng β-carotene trong các tế bào bị thiếu hụt nitrogen là do sự hình thành nhiều
gốc tự do trong điều kiện ức chế. β-carotene có các đặc tính chống oxy hóa dập tắt
các gốc tự do, khôi phục trạng thái cân bằng sinh lý, bảo vệ tế bào để tiếp tục tăng

(NaCl), ở 5M (NaCl) tế bào trắng hoàn toàn sau 2 ngày bổ sung muối. Nồng độ
muối cao tạo ra môi trường ưu trương làm cho các tế bào bị co lại, cuối cùng làm
phá vỡ cấu trúc và thành phần của tế bào (plasmolysis). Ở mơi trường có độ muối
1,5M (NaCl), độ muối thấp tạo nên môi trường nhược trương làm cho tế bào căng
phồng lên và phá vỡ tế bào. Ở độ muối 2M (NaCl) đạt được sinh khối tối đa, là
nồng độ tối ưu cho sự tăng trưởng của tế bào. Khi tế bào bị thiếu nước do nồng độ
muối cao, quang hợp bị ảnh hưởng mạnh. Vì thế hàm lượng diệp lục tố giảm khi độ
muối tăng. Khi độ muối tăng, nó hoạt động như một yếu tố ức chế làm tăng sản
xuất β-carotene. Hàm lượng diệp lục tố giảm và β-carotene tăng ở độ muối trung
bình. Các tế bào chống chịu được với độ muối cao là do có sự hiện diện của
glycerol có khả năng cân bằng ức chế thẩm thấu ngoại bào. Nồng độ glycerol nội
bào cao gần 50% và đủ để phát triển áp suất thẩm thấu tương ứng để cân bằng với
áp suất thẩm thấu ngoại bào [3], [51].
Sự đáp ứng của D.salina đối với ức chế muối (hình 1.4a) có thể chia làm hai
12


giai đoạn [54]:
(i) Sự điều chỉnh nhanh chóng nồng độ glycerol và glycine betaine giống với
cơ chế điều hòa áp suất thẩm thấu phổ biến ở nấm và thực vật bậc cao.
(ii) Sự đáp ứng dài hạn gồm sự tổng hợp lipid trung tính và tích lũy nhiều
carotenoid.
Những thay đổi bất thường trong áp suất thẩm thấu của môi trường dẫn đến
những thay đổi trật tự lipid màng tế bào, vì thế gây ra sự hoạt hóa một loạt các
protein kinase và cuối cùng dẫn đến sự biến đổi tinh bột thành glycerol trong lục
lạp. Tín hiệu được truyền từ tế bào chất vào lục lạp chưa biết rõ. Ngược lại sự đáp
ứng dài hạn đối với độ muối cao bao gồm những thay đổi trong biểu hiện gene
thông qua một hay nhiều nhân tố phiên mã chưa được xác định, tiếp theo là sự tổng
hợp protein de novo. Những sản phẩm gene được cảm ứng bởi ức chế muối gồm
các sản phẩm phiên mã và protein liên quan đến sự đồng hóa carbon và sắt cũng