Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

221
PHÁT HIỆN VI RÚT GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG
(White Spot Syndrome Virus) TRONG THỨC ĂN
NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ

Trần Thị Tuyết Hoa
1
và Nguyễn Thanh Phương
1

ABSTRACT
The white spot syndrome virus (WSSV) is considered the most devastating
pathogen causing mass mortality in different shrimp faming systems
worldwide. It has been well-documented that this pathogen infects different
hosts/carriers (penaeid shrimps, freshwater prawns, variety crabs species, wild
shrimps); targets various host tissues; and it easily spread through horizontal
and vertical transmission; yet, no effective treatment methods against this
pathogen has been developed. Therefore, this study aims at obtaining
information on the new host ranges of WSSV in shrimp culture areas in
Mekong delta in order to understand the transmission pathway of this virus for
appropriate management strategies.
In this study, nested polymerase chain reaction with WSSV-specific primers
was applied to detected the WSSV in live foods (squids, hermit crabs,
polychaete and mantis shrimps - 130 samples) collected from 33 Penaeus
monodon hatcheries in the Bac Lieu and Ca Mau province, Mekong Delta.
Additionally, the confirmation of WSSV infection in these hosts was done by the
histology method (H&E) and nested PCR (IQ2000-WSSV). The results of those
two methods led to the suggestion that WSSV did infect the live foods. In
addition, the amplified product of PCR-genotyping from the DNA of WSSV

33 trại sản xuất tôm sú giống ở tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau, ĐBSCL. Song song
đó, phương pháp mô bệnh học (nhuộm Hematoxyline & Eosin) và phương
pháp PCR hai bước (kit IQ2000-WSSV) cũng được sử dụng như là phương
pháp kiểm khẳng định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu này. Kết quả của
hai phương pháp trên cho thấy sự tồn tại của WSSV trong các mẫu thức ăn
tươi sống được kiểm tra. Ngoài ra, sản phẩm PCR-genotyping của các mẫu
ADN-WSSV chiết tách từ các mẫu thức ăn tươi sống này cũng cho kết quả
tương tự các mẫu ADN-WSSV chiết tách từ tôm sú nuôi ở các ao tôm thuộc khu
vực ĐBSCL.
Từ khóa: Vi rút gây bệnh đốm trắng, thức ăn tươi sống, trại sản xuất tôm sú
1 GIỚI THIỆU
Vi rút gây bệnh đốm trắng được phát hiện đầu tiên ở Fujian, Trung Quốc vào
khoảng năm 1992 (Cai et al., 1995), sau đó tiếp tục lan rộng khắp khu vực
châu Á (Flegel, 1997). Năm 1995, WSSV được phát hiện lần đầu ở khu vực
châu Mỹ (Nunan & Lightner 1997) và sau đó hiện diện ở khắp các nước thuộc
khu vực Tây bán cầu (Mexico, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Panama,
Ecuador và Colombia).
WSSV là tác nhân gây chết tôm cấp tính trên diện rộng, tác động lớn đến năng
suất tôm nuôi và sinh kế của ngườ
i nuôi tôm ven biển. Tác nhân này đã được
ghi nhận cảm nhiễm với số lượng loài lớn, từ các loài giáp xác nuôi vùng nước
ngọt, lợ cho đến các nhóm loài hoang dã ngoài môi trường tự nhiên (copepods,
polychaete…) (Hameed et al., 2003, Jiravanichpaisal et al., 2001, Vijayan et
al., 2005). Phổ loài cảm nhiễm rộng là một trong những nguyên nhân dẫn đến
việc lây lan nhanh của tác nhân này trong hệ thống nuôi tôm trên toàn thế giới.
Ngoài ra, tốc độ lây lan nhanh trong hệ thống nuôi còn có thể là do tôm nhiễm
bệnh qua nguồn nước hoặc là từ việc ă
n tôm chết do WSSV (Chou et al.,
1998).
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

vấn đề nghiên cứu khả năng tồn tại của WSSV trong các mẫu này là rất cần
thiết.
2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Tổng số 130 mẫu thức ăn tươi sống (mực, ốc mượn hồn, giun nhiều tơ – không
xác định loài và tôm tít) được thu ở các trại sản xuất tôm giống thuộc huyện
Năm Căn, tỉnh Cà Mau và tỉnh Bạc Liêu trong khoảng tháng 3-5/2009. Các
mẫu tôm sú thịt được thu từ các ao nuôi tôm thuộc huyện Cái Nước, tỉnh Cà
Mau. Mẫu được thu sống và bảo quản trong cồn tuyệt đối (mẫu PCR) hoặc
dung dịch Davidson’s AFA (mẫu mô).
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

224
2.2 Phương pháp PCR phát hiện WSSV
Qui trình nested-PCR sử dụng các đoạn mồi P1, P2, P3, P4 (Kimura et al.,
1996) để phát hiện WSSV (Bảng 1). Qui trình được thiết kế bao gồm hai bước
với thành phần phản ứng của các bước như sau: (i) thành phần phản ứng bước
1 (20 μl): 1X PCR buffer; 1,5 mM MgCl
2
; 200 μM dNTPs mix, 20 pmol mồi
P1; 20 pmol mồi P2; 1,5 U DNA Taq Polymerase và mẫu ADN chiết tách (1
μl); (ii) thành phần phản ứng bước 2 (20 μl): 1X PCR buffer; 1,0 mM MgCl
2
;
200 μM dNTPs mix, 20 pmol mồi P3; 20 pmol mồi P4; 1,5 U DNA Taq
Polymerase và sản phẩm PCR bước 1 (1 μl). Điều kiện phản ứng PCR của hai
bước được thực hiện ở cùng điều kiện như sau: nhiệt độ 94
o
C trong 5 phút, tiếp
theo 94

AFA, sau 48h giờ được chuyển sang dung dịch cồn 70
o
. Phương pháp thực
hiện theo qui trình bao gồm các bước xử lý mẫu, đúc khối, cắt và dán lát cắt
vào phiến kính. Tiêu bản sau đó được nhuộm với Haematoxylin và Eosin
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

225
(H&E), quan sát và đọc mẫu mô dưới kính hiển vi quang học. Những tế bào có
nhân phì đại bắt màu hồng đỏ đều, có tính kiềm là thể vùi của WSSV.
2.5 Phương pháp PCR-genotyping
Qui trình PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại kép 45 bp và 102 bp thuộc
ORF75 được thực hiện với thành phần phản ứng gồm có 1µl ADN mạch
khuôn; 1X PCR buffer; 1,5 mM MgCl
2
; 10 mM dNTP mix; 2,0 U Taq DNA
polymerase (Promega); 20 pmol mồi ORF75 flank-Forward và 20 pmol mồi
ORF75 flank-Reverse (Bảng 2).
Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng trong các phản ứng PCR-genotyping
Điều kiện phản ứng bao gồm các bước 94
o
C trong 30 giây, 49
o
C trong 30 giây,
72
o
C trong 30 giây. Lặp lại 30 chu kì và cuối cùng là kéo dài ở 72
o
C trong 10
phút.

ORF75 flank - Reverse CAACAGGTGCGTAAAAGAAG Dieu et al, 2004
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

226
như mực, ốc mượn hồn, tôm tít, giun nhiều tơ… trong khi các trại sản xuất tôm
ở Cà Mau chỉ sử dụng một loại thức ăn tươi sống là ốc mượn hồn.
Các mẫu thức ăn tươi sống được thu và chiết tách ADN, khuếch đại PCR để
phát hiện WSSV bằng qui trình nested-PCR (Kimura et al., 1996). Kết quả của
qui trình PCR phát hiện sự tồn tại của WSSV trong các mẫu ốc mượn hồn, mẫ
u
mực, mẫu tôm tít và mẫu giun nhiều tơ.
Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện WSSV trên ốc mượn hồn, mực
và tôm tít
Giếng M - thang DNA 1kb plus
Giếng 1, 2 - DNA chiết tách mẫu ốc mượn hồn dương tính với WSSV
Giếng 3 - DNA chiết tách mẫu giun nhiều tơ dương tính với WSSV
Giếng 4 - DNA chiết tách mẫu mực dương tính với WSSV
Giếng 5, 6 - DNA chiết tách mẫu tôm tít dương tính với WSSV
Giếng 7: đối chứng dương
Giếng 8: đối chứng âm
Hình 1 cho thấy, WSSV hiện diện trong các mẫu ốc mượn hồn được phát hiện
bằng phương pháp PCR. Trong đó có cả mẫu thu ở Bạc Liêu (giếng 1) và mẫu
thu ở Cà Mau (giếng 2). Những mẫu này xuất hiện đồng thời hai vạch tương
ứng 570 bp của WSSV và 240 bp là nội chuẩn của bộ giáp xác mười chân.

Palaemonidae, Ephydridae). Yan et al., (2004) đã thực hiện thí nghiệm cho
thấy rằng WSSV tồn tại trong luân trùng và có khả năng là phương thức lây lan
cho tôm. Đây là những nhóm loài hiện diện nhiều trong ao nuôi tôm và được
chứng minh là ph
ương thức lan truyền WSSV trong ao nuôi. Otta et al., (1999)
cũng đã dùng kỹ thuật PCR 2 bước phát hiện WSSV trên các loài giáp xác nuôi
và tự nhiên ở Ấn Độ. Nghiên cứu này phát hiện WSSV trên nhiều đối tượng
khác nhau (tôm, cua, Artemia…), cả trên đối tượng biểu hiện bệnh và không
biểu hiện bệnh đốm trắng.

3.2 Xác định sự nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSV-
IQ2000
Hình 2. Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với bộ kit IQ2000
Giếng M - thang DNA 1kb plus
Giếng 1 - ADN chiết tách từ mẫu ốc của Cà Mau
Giếng 2, 4 - ADN chiết tách từ mẫu ốc của Bạc Liêu
Giếng 3 - ADN chiết tách từ mẫu mực của Bạc Liêu
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

228
Bộ kít WSSV-IQ2000 là một trong những sản phẩm được tổ chức thú y thế
giới (OIE) xác định về độ nhạy và chính xác cho việc phát hiện WSSV trong
mẫu động vật thủy sản. Do vậy, một số mẫu ADN chiết tách từ mực và ốc
mượn hồn được chọn để kiểm tra với bộ kít WSSV-IQ2000. Các mẫu này đều
đã được xác định dương tính với WSSV bằng phương pháp nested-PCR
(Kimura et al., 1996). Kết quả cho thấy các mẫu được kiểm tra đều bị nhiễm
WSSV với cường độ nhẹ (hình 2). Các mẫu hiện vạch tương ứng 296 bp (giếng
1,2,3,4) và xuất hiện cả vạch nội chuẩn tương ứng 848 bp (giếng 2).
Kết quả này góp phần khẳng định sự nhiễm WSSV trong các mẫu được nghiên
cứu. Tuy sản phẩm PCR khi sử dụng bộ kít WSSV-IQ2000 cho vạch không rõ

500bp
1000bp
500bp
1000bp
500bp
1000bp
500bp
1000bp
1 2 M 3 4 5 M
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

229
Giếng M - thang DNA 100 bp plus
Giếng 1, 2 - ADN chiết tách mẫu ốc mượn hồn dương tính với WSSV
Giếng 3, 4, 5 - ADN chiết tách mẫu tôm sú dương tính với WSSV
Marks et al., (2004) đã so sánh trình tự gen hoàn chỉnh của 3 dòng WSSV thu
được ở Thái Lan, Đài Loan và Trung Quốc và cho nhận xét về tính tương đồng
của ba hệ gen này là khoảng 99,32%. Điểm khác biệt được phát hiện bao gồm
5 vị trí khác nhau trong đó có vùng lặp lại thuộc ORF75 được sử dụng trong
nghiên cứu này. Kết quả ghi nhận được ở hình 3 cho thấy, cấu trúc vùng gen
lặp lại của ORF75 là giống nhau giữa ADN-WSSV chiết tách từ tôm sú và ốc
mượn hồn. Điều đó cho thấy, WSSV hiện diện trong các mẫu thức ăn tươi sống
có cùng kiểu gen với WSSV phân lập từ mẫu tôm sú nuôi.
3.4 Xác định sự nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn với phương pháp mô
học
Kết quả nghiên cứu mô học trên ốc mượn hồn cũng cho dấu hiệu đặc trưng khi
nhiễm WSSV. Các tế bào của mô liên kết có sự hiện diện của các thể vùi
WSSV với vùng sáng bao quanh (hình 4). Tế bào có nhân phì đại và khoảng
vùng sáng bao quanh, đúng với mô tả về tác động của WSSV trên tế bào vật
chủ (Lo et al., 1997).

tươi sống dùng trong các trại sản xuất giống để qua đó đề xuất các biện pháp
phòng bệnh cho phù hợp với từng địa phương.
LỜI CẢM TẠ
Tác giả xin chân thành cảm ơn sinh viên Cao Chí Thuận, lớp Bệnh học
Thủy sản K31 và học viên Đào Bá Cường cao học K14 đã cùng tham
gia quá trình thu và phân tích mẫu nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Cai S., Huang, J., Wang, C., Song, X., Sun, X., Yu, J., Zhang, Y. and Yang, C.,
1995. Epidemiological studies on the explosive epidemic disease of prawn in
1993–1994. J. Fish. China, 19: 112-117.
Chou, H.Y., Huang, C.Y., Lo, C.F., Kou, G.H., 1998. Studied on transmission of
white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) in Penaeus monodon
and P. japonicus via waterborne contact and oral ingestion. Aquaculture, 164
(1-4): 263 - 276.
Dieu, B. T. M., Marks, H., Siebenga, J., Goldbach, R., Zuidema, D., Duong, T. P.
& Vlak, J. M., 2004. Molecular epidemiology of white spot syndrome virus
within Vietnam. J Gen Virol, 85: 3607-3618.
Flegel T.W., 1997. Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus
monodon) in Thailand. World J Microbiol Biotechnol, 13:433-442.
Hossain, M.S., Otta, S.K., Karunasagar, I. and Karunasagar, I., 2001. Detection of
white spot syndrome virus (WSSV) in wild captured shrimp and in non-
cultured crustaceans from shrimp ponds/ghers in Bangladesh by polymerase
chain reaction. Fish Pathol,.36: 93–95.
Kimura T., Yamano K., Nakano H., Momoyama K., Hiraoka M. & Inouye K.
1996. Detection of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV) by PCR. Fish
Pathology, 31: 93–98.
Lo, C. F., Ho, C. H., Peng, S. E., Chen, C. H., Hsu, H. E., Chiu, Y. L 1996. White
spot syndrome baculovirus (WSSV) detected in cultured and captured shrimp,
crabs and other arthropods. Diseases in Aquatic Organisms, 27: 215 -225.
Lo, C.F., Ho, C.H., Chen, C.H., Liu, K.F., Chiu, Y.L., Yeh, P.Y., Peng, S.E., Hsu,

Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India.
Diseases in Aquatic Organisms, 78: 189-198.
Jiravanichpaisal P., Bangyeekhun E., Soderha ll K., So¨derhall I., 2001.
Experimental infection of white spot syndrome virus in freshwater crayfish
Pacifastacus leniusculus. Diseases in Aquatic Organisms, 47:151-157.
Sahul-Hameed A.S., Balasubramanian G., Syed-Musthaq S., Yoganandhan K.,
2003. Experimental infection of twenty species of Indian marine crabs with
white spot syndrome virus (WSSV). Diseases of Aquatic Organisms, 57:157-
161.
Supamataya K., Hoffmann R.W., Boonyaratpalin S. & Kanchanaphum P., 1998.
Experimental transmission of white spot syndrome virus (WSSV) from black
tiger shrimp Penaeus monodon to the sand crab Portunus pelagicus, mud crab
Scylla serrata and krill Acetes sp. Diseases of Aquatic Organisms, 32: 79-85.
Vanpatten K.A., Nunan L.M., Lightner D.V., 2004. Seabirds as potential vectors
of Penaeid shrimp viruses and the development of a surrogate laboratory
model utilizing domestic chickens. Aquaculture, 241:31-46.
Vijayan K.K., Raj V.S., Balasubramanian C.P., Alavandi S.V., Sekhar V.T.,
Santiago T.C., 2005. Polychaete worms – a vector for white spot syndrome
virus (WSSV). Diseases of Aquatic Organisms, 63:107-111.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 221-232 Trường Đại học Cần Thơ

232
Yan D.C., S.L. Dong, J. Huang, X.M. Yu, M.Y. Feng and X.Y. Liu, 2004. White
spot syndrome virus (WSSV) detected by PCR in rotifers and rotifer resting
eggs from shrimp pond sediments. Diseases of Aquatic Organisms, 59: 69-73