TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA HOÁ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN
TỈ LỆ NHIỄM KHI PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH
PHẦN DINH DƯỠNG BỔ SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG
NHÂN GIỐNG CẤP 1, CẤP 2 LÊN SỰ PHÁT TRIỂN
CỦA HỆ SỢI NẤM RƠM (Volvariella volvacea)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. LÊ VĨNH THÚC

MAI HOÀNG
MSSV: 3112364
LỚP: Sinh học K37

Cần Thơ, 2014


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC


Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Cán bộ hướng dẫn

TS. Lê Vĩnh Thúc


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Cử nhân
ngành Sinh học với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA HOÁ CHẤT KHỬ TRÙNG ĐẾN TỈ LỆ NHIỄM
KHI PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG BỔ
SUNG VÀO MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG CÂP 1, CẤP 2 LÊN SỰ
PHÁT TRIỂN CỦA HỆ SỢI NẤM RƠM (Volvariella volvacea)

Do sinh viên Mai Hoàng thực hiện và bảo vệ trước Hội đồng.
Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
Luận văn tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức: .........................................
Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Chủ tịch Hội đồng


Trân trọng.


Mai Hoàng, 2014. Ảnh hưởng của hoá chất khử trùng đến tỉ lệ nhiễm khi phân
lập và xác định thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nhân giống
cấp 1, cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm (Volvariella volvacea). Luận
văn tốt nghiệp Cử nhân ngành Sinh học. Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại
học Cần Thơ, 39 trang. Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Vĩnh Thúc.
TÓM LƯỢC
Đề tài “Ảnh hưởng của hoá chất và thời gian khử trùng đến tỉ lệ nhiễm
khi phân lập và xác định thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nhân
giống cấp 1, cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm (Volvariella
volvacea)” được thực hiện nhằm mục tiêu tìm ra hoá chất và thời gian khử
trùng thích hợp sao cho tỉ lệ nhiễm của mẫu nấm khi phân lập là thấp nhất; xác
định được thành phần và tỉ lệ dinh dưỡng tự nhiên được bổ sung vào môi
trường nhân giống cấp 1 và cấp 2 phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm
rơm. Đề tài được thực hiện bao gồm 3 thí nghiệm đều được bố trí theo thể
thức hoàn toàn ngẫu nhiên: (1) Ảnh hưởng của hoá chất khử trùng lên tỉ lệ
sạch khi phân lập nấm rơm. Thí nghiệm có hai nhân tố, nhân tố 1 là 5 loại hóa
chất (Ca(ClO)2 10%; Ca(ClO)2 20%; NaClO 10%; NaClO 20%; cồn 70o) và
nhân tố 2 là hai mốc thời gian ngâm mẫu (1 phút; 5 phút); (2) Ảnh hưởng của
dinh dưỡng bổ sung lên sự phát triển của khuẩn lạc nấm rơm trên đĩa petri. Thí
nghiệm có 1 nhân tố, gồm 4 nghiệm thức sau: PDA bổ sung (20% dịch chiết
cám; 20% dịch chiết giá; 20% dịch chiết bột bắp và đối chứng). (3) Ảnh
hưởng các loại cơ chất của môi trường cấp 2 đến tốc độ phát triển tơ nấm rơm.
Thí nghiệm có 1 nhân tố, gồm 6 nghiệm thức sau: lúa; trấu; lúa + 10% cám;
lúa + 10% bột bắp; trấu + 10% cám; trấu + 10% bột bắp. Kết quả thí nghiệm
1: Ca(OCl)2 20% khử trùng mẫu trong thời 1 phút hay NaOCl 10% trong 5
phút cho tỉ nhiễm 0% sau 5 ngày cấy mẫu. Kết quả thí nghiệm 2: hệ sợi nấm
rơm phát triển tốt nhất trên môi trường PDA bổ sung 20% dịch chiết cám sau

2.9.1 Cám gạo ....................................................................................... 13
2.9.2 Bột bắp ........................................................................................ 14
2.9.3 Trấu.............................................................................................. 14
2.10 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...................................... 15
2.10.1 Một số nghiên cứu trong nước .................................................. 15
2.10.2 Một số nghiên cứu trên thế giới ................................................ 15
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................ 17
3.1 Phương tiện nghiên cứu ..................................................................... 17
3.1.1 Địa điểm - Thời gian thực hiện ................................................... 17
3.1.2 Vật liệu thí nghiệm ...................................................................... 17
3.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 17
3.2.1 Môi trường cơ bản (PDA) được dùng trong thí nghiệm ............. 17
3.2.2 Thu dịch chiết bột bắp, cám gạo ................................................. 18
3.2.3 Thu dịch chiết giá đậu xanh ........................................................ 18
3.2.4 Chuẩn bị nguyên liệu lúa và trấu ................................................. 18
3.2.5 Bố trí thí nghiệm.......................................................................... 18

Chuyên ngành Sinh học

i

Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

3.3 Phương pháp phân tích số liệu ........................................................... 22
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 23

Trang

Thành phần (%) các chất dinh dưỡng trong cám gạo trước và

13

sau khi được phân giải bởi các enzyme của nấm rơm
2.2

Thành phần khoáng của cám gạo trước và sau khi được phân

13

giải bởi enzyme của nấm rơm (ppm)
2.3

Thành phần dinh dưỡng của cám bắp vàng

14

3

Bố trí thí nghiệm 1

19

4.1

Tỉ lệ không nhiễm (%) của mẫu khi phân lập (sau 5 ngày



Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Nội dung

Hình

Trang

2.1

Quả thể nấm rơm (Giai đoạn hình trứng)

3

2.2

Các giai đoạn phát triển của nấm rơm

4

2.3

Giai đoạn đinh ghim, hình nút nhỏ, hình nút, hình trứng


12

2.9

Công thức hoá học của cồn

12

3.1

Kích thước mô nấm được lấy ra và cấy vào môi trường PDA

20

3.2

Kích thước vùng tơ nấm được cấy chuyền

21

4.1

Tỉ lệ nhiễm của mẫu từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 5 sau cấy

22

4.2

Tơ nấm phát triển sau 5 ngày cấy

4.7

Sự phát triển của tơ nấm rơm trên các môi trường cấp 2

33

Chuyên ngành Sinh học

iv

Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
PDA

Potato Dextrose Agar

Ca(OCl)2

Calcium hypochlorite

NaOCl

Sodium hypochlorite


nhiễm. Theo Vũ Văn Vụ (2007) ở nước ta thường sử dụng dung dịch
Ca(OCl)2, NaOCl, cồn 70o,…để khử trùng mẫu, tuy nhiên đối với nấm ăn thì
vẫn chưa có công trình nghiên cứu cụ thể và công bố kết quả.
Adenipekun và Gbolagade (2006) cho rằng sự phát triển của nấm đòi hỏi
được cung cấp thêm các dưỡng chất khác như: glucose, protein và khoáng.
Mặt khác, trong thành phần của cám gạo hay bột bắp lại chứa nhiều thành
phần dinh dưỡng trên (Melissa, 2012). Ukoima và ctv. (2009) đã bổ sung dịch
chiết cám vào môi trường nuôi cấy nấm. Dương Hải Nguyên (2009) sử dụng
lúa bổ sung cám gạo để tạo meo nấm rơm. Phần lớn các loại meo giống nấm
trên thị trường sử dụng trấu bổ sung các thành phần dinh dưỡng như cám, bột
bắp,…Tuy nhiên, về thành phần và tỉ lệ cụ thể của giống nấm thì người trồng
nấm vẫn chưa được biết rõ để có thể chủ động tạo nguồn meo giống. Chang và
Miles (2004) cũng sử dụng môi trường trấu có bổ sung dinh dưỡng để tạo meo
nấm. Vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng của hoá chất khử trùng lên tỉ lệ nhiễm của
tơ nấm khi phân lập và xác định thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi

Chuyên ngành Sinh học

1

Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

trường nhân giống cấp 1, cấp 2 lên sự phát triển của hệ sợi nấm rơm
(Volvariella volvacea)” được thực hiện nhằm mục tiêu tìm ra hoá chất và thời
gian khử trùng thích hợp sao cho tỉ lệ nhiễm của mẫu nấm khi phân lập là thấp

vào năm 1822 (Chang, 1969). Sau đó được lan rộng và phát triển ở Việt Nam,
Malaysia, Myanma, Philippin, Thái Lan, Nhật Bản, Triều Tiên, Hàn Quốc,…
(Nguyễn Lân Dũng, 2001).
2.1.1 Các giai đoạn phát triển của nấm rơm
Theo Chang và Miles (2004) quá trình tạo quả thể của nấm rơm được
chia thành sáu giai đoạn khác nhau: đầu kim, nút nhỏ, nút, trứng, kéo dài và
giai đoạn trưởng thành. Mỗi chủng nấm rơm có hình thái giải phẩu riêng:

Chuyên ngành Sinh học

3

Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 2.2 Các giai đoạn phát triển của nấm rơm
(*Nguồn Chang, 2004)

Đặc điểm các giai đoạn phát triển của nấm rơm theo Ahlawat (2007):
1. Giai đoạn đầu kim: giai đoạn này nấm rơm có kích thước của một đầu
kim, bao gốc có màu trắng (Hình 2.3). Trong đó phiến nấm, mũ nấm và
cuống nấm chưa hình thành. Toàn bộ cấu trúc là một nút thắt của các
sợi nấm.
2. Nút nhỏ: cả hai giai đoạn đầu kim và nút nhỏ đều được hình thành từ
sự đan xen của các sợi nấm. Ở giai đoạn đầu của nút nhỏ, chỉ có đầu
của bao gốc là có màu nâu, phần còn lại là màu trắng (Hình 2.3). Bên

(*Nguồn: Ahlawat, 2007)

6. Giai đoạn trưởng thành: Ở giai đoạn trưởng thành, cấu trúc được chia
thành ba phần: mũ nấm, cuống nấm hay thân nấm và phiến nấm, mũ
nấm được gắn ở trung tâm bằng cuống nấm và thường có đường kính 612 cm. Mũ nấm hoàn toàn trưởng thành có hình dạng tròn với mép liền,
bề mặt nhẵn. Bề mặt có màu xám tối tại trung tâm và màu xám sáng
gần mép. Mặt dưới của mũ nấm là những phiến nấm với số lượng khác
nhau từ 280-380. Phiến nấm thay đổi từ kích thước đầy đủ đến ¼ kích
thước mũ nấm. Dưới kính hiển vi, mỗi phiến nấm được quan sát, phiến

Chuyên ngành Sinh học

5

Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

nấm được hình thành từ ba lớp nấm sợi đan xen. Các lớp ngoài cùng
được gọi là màng bao.

Hình 2.5 Giai đoạn trưởng thành
2.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm rơm ở giai đoạn trưởng thành
Bao gốc
Theo Đường Hồng Dật (2002) bao gốc dài và cao lúc nhỏ, bao lấy tai
nấm. Khi tai nấm trưởng thành, nó chỉ còn lại phần trùm lấy phần gốc chân
thân nấm. Bao nấm là hệ sợi tơ nấm chứa sắc tố melanin tạo ra màu đen ở gốc.

mặt tế bào sợi. Nấm có hệ enzyme phân giải tương đối mạnh giúp chúng có
thể sử dụng các dạng thức ăn phức tạp, bao gồm các đại phân tử như chất xơ
(cellulose,

hemicellulose),

chất

đạm

(protein),

chất

bột

(amidon,

polysacharide), chất mộc (lignin), … Với cấu trúc sợi tơ nấm len lỏi sâu vào
trong cơ chất (rơm rạ, mạc cưa, gỗ, …) hấp thụ chất dinh dưỡng đem nuôi
toàn bộ cơ thể nấm.
Theo Lê Duy Thắng (1997) cho rằng các loại nấm đều cần sử dụng Dglucose, là nguồn cacbon chính trong việc tổng hợp các chất và cung cấp năng
lượng cho nấm. Nguồn cacbon hay đường là một yếu tố bắt buộc, không có nó
nấm không thể tăng trưởng hoặc phát triển được. Nấm rơm là loại nấm hoại
sinh, hệ enzyme cellulase của nấm có hoạt tính phân giải được nhiều loại cơ
chất khác nhau, sợi nấm sẽ tiết ra enzyme cellulase phân huỷ các nguồn
carbon trên cơ chất thành dạng dễ sử dụng: monosaccharide, disaccharide để
cung cấp năng lượng cho các quá trình biến dưỡng của tế bào nấm. Nấm rơm
tạo ra một hệ thống enzyme đa thành phần bao gồm các endo-1,4-β-glucanase,
cellobiohydrolase, and β-glucosidase cho việc chuyển đổi cellulose thành

Agar: 20g
Nước cất: điều chỉnh 1 lít
pH: 6,8 - 7,8
2.3 Phương pháp khử trùng bề mặt
Theo Vũ Văn Vụ và ctv., 2007 khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhất, vì
chúng sẽ tạo ra được nguồn mẫu invitro ban đầu. Mục đích của khử trùng mẫu
là loại hết những vi sinh vật gây nhiễm bám trên mẫu, nhằm tạo được lượng
mẫu sống và vô trùng cao nhất cho nuôi cấy. Khử trùng mẫu cấy thường sử
dụng các hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật như: calcium hypochlorite
[Ca(OCl)2], thuỷ ngân clorua (HgCl2), Chloramin B, sodium hypochlorite
(NaOCl), oxy già (H2O2), các chất kháng sinh, … Trong đó, [Ca(OCl)2] và
(NaOCl) được sử dụng nhiều hơn vì chúng có độc tính thấp đối với mô cấy và
an toàn cho người sử dụng, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt
khuẩn tốt, mà giá thành lại rẽ. Tuy nhiên, khả năng diệt khuẩn của hoá chất
phụ thuộc vào thời gian, nồng độ xử lý và mức độ xâm nhập của vi sinh vật
trên bề mặt mô cấy.
2.4 Phương pháp phân lập nấm rơm từ quả thể
Phương pháp phân lập nấm rơm từ quả thể theo Ahlawat và Tewari
(2007):

Chuyên ngành Sinh học

8

Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Sinh học

9

Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

Nước 140-160%
2.7 Meo giống gốc
Theo Chang và Miles (2004) hay Ahlawat và Tewari (2007) meo giống
bao gồm tất cả dạng trung gian, chứa đựng sinh khối của loài nấm dự định
nuôi trồng. Nguyên liệu làm meo giống có thể ở dạng hạt (như lúa, bo bo hoặc
các hạt ngũ cốc khác), dạng phế liệu (như rơm, trấu, vỏ hạt sen, mạt cưa gỗ, sơ
dừa, …) hoặc dạng dung dịch (như rỉ đường). Tóm lại là các giá thể (các cơ
chất nuôi nấm) dễ dàng cho nấm mọc, nhưng cũng dễ dàng phân tán khi cấy
giống vào nguyên liệu nuôi trồng. Sinh khối nấm như meo giống gốc thường
là hệ sợi tơ nấm (tơ thứ cấp), đôi khi cũng có thể là bào tử nấm. Điểm quan
trọng là giống cấy phải thuần, nghĩa là không bị lẫn tạp với vi khuẩn, nấm mốc
và loài nào khác (Lê Duy Thắng, 1997).
Trong thực tế, việc sản xuất giống nấm là một khâu đặc biệt quan trọng
trong toàn bộ quá trình nuôi trồng, quyết định đến sản lượng và chất lượng của
nấm làm ra. Meo giống tốt không những mọc nhanh và mạnh trên nguyên liệu
nuôi trồng, chống chịu được các mầm bệnh mà còn có năng suất cao, giá trị
thương phẩm tốt, chậm thoái hoá (Lê Duy Thắng, 1997).
Chỉ tiêu đánh giá chất lượng meo giống nấm theo Nguyễn Hữu Đống
(1997)

Nhân giống gốc

Cấy vào môi trường
cấp 2

Cơ chất

Giai đoạn ủ giống

Sẵn sàng sử dụng để
trồng nấm

Hình 2.6 Quy trình tạo meo giống nấm rơm
(*Nguồn: Federico, 1997)

2.8 Hoá chất khử trùng
2.8.1 Dung dịch Sodium hypochoride (NaOCl)

Hình 2.7 Công thức hoá học của Sodium hypochlorite
Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox
(chiếm 5 - 20%). Tác dụng khử khuẩn của dung dịch hypochlorite là clo được
phóng thích và phá huỷ màng tế bào của cá vi sinh vật bám trên mẫu, bất hoạt

Chuyên ngành Sinh học

11

Khoa Khoa học Tự Nhiên



Khoa Khoa học Tự Nhiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khoá 37

Trường Đại học Cần Thơ

2.9 Thành phần dinh dưỡng các chất của môi trường cấp 2
2.9.1 Cám gạo
Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn chiếm khoảng 10 - 12% khối
lượng lúa chưa xay xát. Cám được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phôi
của hạt, những hạt gạo bị gãy vỡ, cũng như một phần từ tấm. Thành phần của
cám gạo có nhiều loại vitamin, chất béo và nhiều xơ dễ tiêu (Melissa, 2012).
Ngày nay, cám gạo đã được ổn định bằng cách xử lý nhiệt để làm giảm
sự thủy phân và oxy hóa của dầu. Cám gạo chứa nhiều thành phần dinh dưỡng
cơ bản như protein, tinh bột, axit béo, các hợp chất phenolic, vitamin nhóm B,
khoáng vi lượng, xơ hòa tan. Cám gạo rất giàu chất xơ hòa tan, mặc dù không
được tiêu hóa nhưng nó có nhiều chức năng sinh học khác, một trong những
chức năng quan trọng là sự kích thích sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật
có lợi (Vogt, 2003).
Kết quả nghiên cứu của Akinyele và ctv. (2011):
Bảng 2.1 Thành phần (%) các chất dinh dưỡng trong cám gạo trước và
sau khi được phân giải bởi các enzyme của nấm rơm
Cám
gạo

Tỉ lệ %
Chất xơ

Chất đạm


2,41

3,55

42,05

*Ghi chú: a: mẫu trước khi sử dụng (chưa được enzyme nấm rơm phân giải), b: mẫu sau khi sử
dụng (sau khi được sử phân giải của enzyme nấm rơm).

Bảng 2.2 Thành phần khoáng của cám gạo trước và sau khi được phân
giải bởi enzyme của nấm rơm (ppm)
Cám gạo

Ca2+

Mg2+

N+

K+

P-5

a

0,38

0,21

Trích đoạn Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của dinh dưỡng bổ sung vào môi trường

---