Luận văn cao học

Hoàng Anh

MỞ ĐẦU
Hiện nay, bệnh dịch AIDS là một trong những mối nguy hiểm lớn nhất của
thế giới. Ước tính đã có khoảng 20 triệu người chết vì AIDS, và hiện đang có 39
triệu người trên thế giới đang mang HIV và hàng triệu ca nhiễm mới mỗi ngày (theo
UNAIDS, 2007). Bệnh dịch làm tăng nhanh sự nghèo đói và hủy hoại tương lai của
những người mắc bệnh do đó là mối đe dọa lớn đến tình hình kinh tế, xã hội và
chính trị đối với rất nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam [1].
Trong những năm gần đây, tình hình lây nhiễm HIV/AIDS ở Việt Nam diễn
biết rất phức tạp, số người phát hiện nhiễm tiếp tục tăng. Hầu hết những người
nhiễm HIV là do tiêm chính ma tuý và đang ở độ tuổi thanh thiếu niên. Tính đến
ngày 16/7/2007, cả nước đã phát hiện được 129.110 người nhiễm HIV; trong đó
25.470 người chuyển sang AIDS, 14.195 người đã tử vong do HIV/AIDS. Theo các
chuyên gia y tế, số người được phát hiện nhiễm HIV/AIDS là thấp hơn nhiều so với
thực tế. Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợp
nhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp
tử vong vì HIV/AIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 20-30 ngàn trường hợp
nhiễm mới. Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIV/AIDS ở
nước ta [2,3,5].
Hiện chưa có biện pháp nào có thể tiêu diệt hoàn toàn được HIV. Các loại
vắcxin phòng chống HIV chưa thực sự có hiệu lực cộng với sự kháng các loại thuốc
kháng virut và những hoạt động tiêm chích, mại dâm làm cho sự lây lan dịch bệnh
này càng ngày càng nhanh chóng và trở nên khó kiểm soát Phương pháp hay được
sử dụng để điều trị HIV/AIDS hiện nay là phương pháp HAART (highly active
antiretroviral therapy) có tác dụng kéo dài tuổi thọ của những người nhiễm HIV.
Tuy nhiên, để sử dụng các phác đồ trị liệu một cách có hiệu quả nhất thì việc chẩn
đoán sớm và chính xác là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu.
Các phương pháp chẩn đoán HIV rất đa dạng, nhưng việc tạo ra các kít chẩn


Hoàng Anh

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 HIV
1.1.1 Khái niệm HIV
Virut gây suy giảm miễn dịch ở người, viết tắt theo tiếng Anh là HIV
(Human Immunodeficiency Virus) là loại virut khi xâm nhập vào cơ thể gây hội
chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), trạng thái mà tại đó, hệ thống miễn
dịch của người bị suy yếu, dẫn đến nguy cơ nhiễm các bệnh cơ hội và làm cho bệnh
nhân dễ mắc các bệnh ung thư và phải chịu những tổn thương do chính HIV gây ra.
Sự nhiễm HIV thông qua việc chuyển các chất dịch như máu, dịch âm đạo,
tinh dịch hoặc sữa từ người bệnh. Trong cơ thể người bệnh, HIV tồn tại ở cả dạng
hạt virut tự do lẫn dạng virut đã bị nhiễm vào các tế bào của hệ thống miễn dịch [13,
14, 55].
1.1.2 Đặc điểm của HIV
1.1.2.1 Đặc điểm phân loại HIV
HIV là một thành viên của chi Lentivirus và thuộc họ Retroviridae [23,24].
Retrovirus là loại virut có genom là ARN sợi đơn dương nhưng trong chu
trình sống có giai đoạn tồn tại ở dạng ADN kép do có enzym phiên mã ngược mà
bản chất là ADN polymeraza phụ thuộc ARN. ADN mới được tạo ra đều có những
đoạn trình tự lặp lại có kích thước khác nhau ở 2 đầu được gọi là đoạn lặp lại đầu
cuối (LTR), nhờ đoạn này mà ADN của virut có thể gắn ổn định trong nhiễm sắc
thể của tế bào nhiễm và trở thành dạng tiền virut (provirus) [24].
Các Lentivirrus đều có đặc điểm hình thái và sinh học giống nhau. Chúng
đều là virut ARN sợi đơn dương có vỏ ngoài. Rất nhiều động vật bị gây nhiễm bởi
lentivirus, Đặc tính của nó là có thời gian mắc bệnh và ủ bệnh dài [23].
HIV gồm 2 loại là HIV-1 và HIV-2, cả 2 loại đều bắt nguồn từ vùng phía
Nam Camerun sau khi truyền từ tinh tinh sang người trong thế kỉ 20. Trước đây,
HIV

điều này giải thích tại sao loại virut này chỉ lưu hành ở Tây Phi.
Trong giới hạn của luận văn này, chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu HIV-1 loại virut gây đại dịch thế giới và cũng là loại chủ yếu thường gặp ở Việt Nam.
1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của HIV
Virut HIV có cấu trúc hình cầu, đường kính 80-120nm. Hạt virion có dạng
hình khối đa diện với cấu trúc đối xứng gồm 20 mặt tam giác đều [12, 20, 46].

Hình 1: Hình thái hạt virion của virut HIV
1.1.2.3 Đặc điểm về cấu trúc của HIV
Từ ngoài vào trong có 3 lớp [55, 57].
Lớp vỏ: Lớp áo ngoài của virut, gọi là vỏ virut, bao gồm 2 lớp, được lấy từ
màng tế bào của người khi hạt virut mới nảy chồi từ tế bào. Các nghiên cứu gần đây
chỉ ra rằng HIV có thể đi vào và đi ra khỏi tế bào thông qua một vùng đặc biệt của
màng tế bào gọi là thảm lipid (Lipid raft). Thảm này có hàm lượng cholesterol và
glycolipid cao và có thể là một điểm đích mới trong việc nghiên cứu các loại thuốc
kháng virut HIV.

4


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Bao quanh lớp vỏ virut là khoảng 72 bản copy của phức hệ protein gai của
HIV (thường gọi là spickes). Phức hệ này được cấu tạo từ các protein vỏ của
virut gọi là protein Env, bao gồm một mũ được tạo thành từ 3 phân tử
glycoprotein có độ dài 9-10 nm và chiều rộng 14 nm có trọng lượng phân tử là
120 kDa và được gắn trên một gốc gồm 3 phân tử glycoprotein GP41 xuyên
màng có trong lượng phân tử 41 kDa neo vào cấu trúc vỏ của virut. Rất nhiều
nghiên cứu để phát triển vacxin HIV tập trung vào các protein vỏ này [21, 54,

- Env: mã hoá cho các protein vỏ là gp120 và gp41.
• Nhóm gen điều hòa: chứa thông tin cần thiết cho các protein điều khiển
sự xâm nhập của HIV vào tế bào vật chủ, tạo ra virut mới và gây bệnh.
- Tat (transactivator) là gen khởi động hoạt động của các gen virut khác.
- Rev: (trans-regulator protein) có chức năng điểu hòa, tạo ra một protein
Rev có 2 đầu, một đầu làm nhiệm vụ ức chế (CRS), một đầu làm nhiệm vụ giải ức
chế (CAR).
- Nef: (negative regulator factor) chịu trách nhiệm làm chậm chu trình sống
của virut trong trạng thái tiềm tan.
- Vif: (virion infectivity factor) mã hóa cho protein kích thích sự xâm nhập
của virut vào tế bào cảm nhiễm.
6


Luận văn cao học

Hoàng Anh

- Vpu: mã hóa cho protein điều khiển quá trình giải phóng các hạt virut mới
từ tế bào bị nhiễm.
- Vpr: cần thiết cho sự nhân lên của virut trong các tế bào không phân chia
như các đại thực bào.
Cuối mỗi chuỗi ARN của HIV có một trật tự ARN gọi là đoạn lặp lại dài ở
cuối (LTR). Các vùng trong LTR hoạt động như các công tắc để khởi động quá
trình tạo thành virut mới và có thể được khởi động nhờ protein của virut và protein
của vật chủ.

7



vùng tương đồng chính (MHR- major homology region) (Hình 5). Đây là vùng bảo
thủ giữa các retrovirut khác nhau và cần thiết cho sự đóng gói, trưởng thành và sự
gây nhiễm của virut [17]. Vùng đầu N của p24 có cấu trúc kẹp tóc beta N-terminal
beta-hairpin. Sự săp xếp của dime CA (146-231) với cấu trúc của vùng đầu N hình

8


Luận văn cao học

Hoàng Anh

thành cấu trúc không gian của protein capsit và tạo điều kiện liên kết kéo về 2 phía
của protein để tạo thành một lõi hình viên đạn của HIV-1.
Vai trò của protein P24
HIV muốn nhân lên được trong tế bào chủ phải trải qua các bước khác nhau.
Protein nucleocapsit có vai trò quan trọng ở các giai đoạn khác nhau trong chu trình
sống của virut.
Trước tiên, P24 tham gia vào quá trình cởi áo sau khi virut xâm nhập vào tế
bào. Sau khi HIV xâm nhập vào tế bào chất của tế bào chủ, các protein trong lõi
capsit tự động tách nhau ra, làm tan rã cấu trúc của lõi capsit, giải phóng ARN
genom vào trong tế bào chất [13].
Sau đó, P24 cũng tham gia vào quá trình sao chép ngược của virut ở chỗ nó
có ảnh hưởng đến mối liên kết giữa ARN và ADN trong giai đoạn đầu của quá trình
nhiễm và hoạt động như là cofactor cho enzym phiên mã ngược.
Protein P24 còn tham gia vào quá trình đóng gói ARN genom với các thành
phần khác của virut. Nó có vai trò đặc biệt trong viêc nhận ra các dấu hiệu đóng gói
của HIV và làm nhiệm vụ trung gian cho sự kết hợp giữa 2 phân tử ARN khác nhau
để hình thành genom của hạt virion HIV-1 mới. Dấu hiệu đóng gói bao gồm các cấu
trúc gồm 4 phần loop được định vị ở gần đầu 5  của ARN genom của virut.

phát triển, xấp xỉ 50% bệnh nhân mở rộng sự sử dụng đồng thụ thể, đáng kể là thụ
thể CXCR4. Virut sử dụng đồng thụ thể CCR5 gọi là R5 HIV và virut sử dụng đồng
thụ thể CXCR4 gọi là X4 HIV [45].
Mặc dù các tế bào TCD4+ là đích chính của HIV, các tế bào khác trong hệ
miễn dịch có hoặc không có CD4 trên bề mặt đều cũng bị nhiễm. Trong số này, các
tế bào có đời sống dài như tế bào đơn nhân (monocyte) và đại thực bào
(Macrophage) có thể mang một lượng lớn HIV mà không bị tiêu diệt. Vì vậy, đây
được coi là chỗ trú ẩn an toàn của HIV. Các tế bào T CD4 + cũng có chức năng chứa
HIV, một lượng nhỏ các tế bào này lưu giữ HIV ở dạng tiềm tan, không hoạt dộng.
10


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Sự đáp ứng miễn dịch thông thường có thể hoạt hóa các tế bào này, gây ra sự tạo ra
các hạt virion mới [48].
Sau khi virut HIV được đẩy vào tế bào chất của vật chủ, nó sẽ thực hiện quá
trình cởi áo, phá vỡ cấu trúc lõi capsit để đẩy ARN genom của virut vào tế bào chất.
1.1.4.2 Sự sao chép và dịch mã
Khi vào trong cơ thể vật chủ, ARN genom sẽ chuyển thành sợi ADN kép nhờ
enzym phiên mã ngược được mang theo virut trong quá trình xâm nhập vào tế bào.
ADN này của virut sẽ được tích hợp vào trong ADN của tế bào bằng enzym tich
hợp của virut. Lúc này, virut có thể thực hiện 1 trong 2 con đường. Con đường thứ
nhất là virut trở thành trạng thái tiềm tan và tế bào nhiễm tiếp tục hoạt động và thực
hiện chức năng của mình. Con đường thứ 2 là virut hoạt động, nhân lên, giải phóng
một lượng lớn virut và tiêu diệt tế bào chủ.
Con đường tiềm tan: ADN mới được tạo ra của HIV được vận chuyển vào
trong nhân của tế bào chủ. Nhờ sự xúc tác của enzym tích hợp intergraza, ADN của

động mạnh, nef hoạt động yếu thì virut ở trạng thái provirus và ngược lại, tat hoạt
động yếu, nef hoạt động mạnh thì virut sẽ ở trạng thái tiềm ẩn. Gen rev điều hòa
hoạt động của 2 gen tat và nef.
Sự tồn tại ở trạng thái tiền virut còn do tác động đến các nhân tố khác, Ví dụ,
các tế bào lympho bị nhiễm HIV sẽ thúc đẩy sự sinh trưởng của HIV bằng các yếu
tố hoại tử khối u (TNF), hoặc do sự nhiễm các tác nhân gây bệnh như
Cytomegalovirus, virut Epstein Barr. Các tác nhân này được gọi chung là yếu tố
kích hoạt sự sinh trưởng của HIV.
1.1.4.3 Lắp ráp và tạo thành virut hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn cuối cùng của chu trình tái tạo virut – tạo thành hạt virut
HIV hoàn chỉnh. Quá trình này bắt đầu tại màng sinh chất của tế bào chủ. Protein
Env (gp160) đi qua màng lưới nội chất và được vận chuyển tới phức hệ Golgi, nơi
mà chúng sẽ bị enzym proteaza phân cắt thành 2 phân tử glycoprotein vỏ là gp41 và
gp120. Các protein này được vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào vật chủ, tại
đó, gp41 và gp120 gắn lên màng của tế bào xâm nhiễm. Các polyprotein Gag 55 và
Gag-Pol (gp160) cũng liên kết với bề mặt bên trong của màng sinh chất cùng với
ARN genom của HIV khi hạt virion bắt đầu định hình và nhú ra từ tế bào vật chủ.
Lúc này, hạt virion chưa có khả năng gây nhiễm. Chỉ khi có sự hoạt động của
proteaza của HIV làm phân cắt các polyprotein thành các enzym và các protein cấu
trúc thi hạt virion mới bước sang giai đoạn thành thục. Sự thành thục của hạt virut
xảy ra từ lúc hạt virion mới bắt đầu nhú ra khỏi màng tế cho đến lúc hạt virut trưởng
thành và tách khỏi màng tế bào. Giai đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi các chất có
khả năng ức chế hoạt động của proteaza, HIV-1 và HIV-2 có cách đóng gói khác
nhau. HIV- 1 sẽ đóng gói ARN bất kì nào, trong khi đó, HIV-2 chỉ ưu tiên gắn các
12


Luận văn cao học

Hoàng Anh

phương pháp điều trị có hiệu quả. Tuy nhiên cả số người sống với HIV và số người
13


Luận văn cao học

Hoàng Anh

tử vong do AIDS vẫn đang tiếp tục tăng lên. Tổng cộng hiện có 39,5 triệu người
đang sống với HIV trong năm 2006, là tăng hơn 2,6 triệu so với năm 2004. Con số
này bao gồm cả số ước tính 4,3 triệu người lớn và trẻ em mới nhiễm HIV trong năm
2006, so với năm 2004 số này tăng hơn 400.000 người. Ở nhiều khu vực trên thế
giới, số mới nhiễm chủ yếu tập trung trong đối tượng thanh niên (15–24 tuổi) [47].
Tính riêng trong số những người từ 15 tuổi trở lên, thanh niên chiếm 40% số người
mới bị nhiễm HIV trong năm 2006 [38].
Bảng 1: Tóm tắt tình hình dịch AIDS toàn cầu (Tháng 12, 2006 )
Số người sống với HIV
năm 2006

Số ca mới nhiễm HIV
trong năm 2006
Số tử vong do AIDS trong
năm 2006

Tổng số
Người lớn
Phụ nữ
Trẻ em dưới 15 tuổi
Tổng số
Người lớn


14


Luận văn cao học

Hoàng Anh

14.195 người đã tử vong do HIV/AIDS. Theo các chuyên gia y tế, số người được
phát hiện nhiễm HIV/AIDS là thấp hơn nhiều so với thực tế [5].
Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợp
nhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp
tử vong vì HIV/AIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 20-30 ngàn trường hợp
nhiễm mới. Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIV/AIDS ở
nước ta, bởi vì sự gia tăng số lượng người nhiễm HIV/AIDS sẽ làm tăng nhu cầu về
điều trị, chăm sóc và hàng loạt các vấn đề khác về phục vụ người bệnh.
1.2.4 Dịch tễ học
1.2.4.1 Con đường lây nhiễm
Có 3 con đường chính của quá trình lây nhiễm là quan hệ tình dục không
lành mạnh, chuyền qua con đường máu và truyền từ mẹ sang con [13, 47, 54, 55].
•

Truyền qua đường tình dục. Đây là con đường lây truyền chính. Nhiễm
HIV qua quan hệ tình dục có thể xảy ra khi người bệnh tiếp xúc với người
kia thông qua tinh dịch, dịch âm đạo hoặc qua các màng nhày.

•

Máu và con đường truyền qua máu. Con đường truyền bệnh này có thể
tính đến việc nhiễm do dùng chung kim tiêm, những người bị bệnh máu khó

HIV kích thích sinh ra là kháng thể kháng protein p24. Quá trình này làm giảm một
lượng đáng kể HIV. Lượng tế bào T CD4+ có thể được tái tạo lại một lượng nào đó
hoặc thậm chí bằng lượng tế bào ban đầu. Sau đó, bệnh nhân không thể hiện một
triệu chứng nào trong vài năm mặc dù HIV vẫn tiếp tục nhân lên trong các cơ quan
lympho [6].
Một đặc điểm chỉ thấy ở HIV là mặc dù có đáp ứng miễn dịch rất mạnh của
cơ thể, có thể đủ để tiêu diệt hầu hết sự nhiễm các loại virut khác, một số HIV vẫn
có thể trốn thoát. Điều này là do một phần lớn của sự đột biến với tốc độ cao xảy ra
trong quá trình sao chép HIV. Thậm chí khi virut không tránh được hệ thống miễn
dịch bằng quá trình đột biến, các thành phần của cơ thể chống lại HIV như các
subset hoặc các tế bào T gây độc nhận ra HIV có thể bị suy yếu và trở nên mất chức
năng.
Thêm vào đó, trong giai đoạn sớm của quá trình nhiễm bệnh, các bệnh nhân
có thể mất các tế bào đáp ứng đặc hiệu HIV là T CD4 + có vai trò tiết interferon và
các yếu tố chống virut khác và sự phối hợp của các tế bào T CD8 +. Các đáp ứng này
bình thường có tác dụng làm chậm quá trình nhân lên của HIV.
Mặt khác, provirut trốn trong các nhiễm sắc thể của tế bào nhiễm và bảo vệ
khỏi sự tấn công của hệ thống miễn dịch. Các tế bào như vậy là nơi trú ngụ an toàn
của virut HIV[26, 47, 54, 55].

16


Luận văn cao học

Hoàng Anh

1.2.4.3 Cơ chế phát sinh bệnh
Sự nhiễm HIV dẫn đến việc giảm lượng tế bào T CD4+ thông qua 3 cơ chế:
• Trực tiếp tiêu diệt các tế bào bị nhiễm

Luận văn cao học

Hoàng Anh

đây đã được sử dụng có thể phát hiện sự nhiễm HIV trong vòng 2 đến 6 tuần sau khi
nhiễm là khoảng 80% và sau 12 tuần là 100%, chỉ có một số ít các trường hợp chi
phát hiện ra sau 3 đến 6 tháng [33].
Phát hiện người nhiễm HIV là một trong những điều kiện cần thiết để có thể
có một phương pháp trị liệu phù hợp nhất, ví dụ bắt đầu dùng HAART đúng lúc có
thể kéo dài thời gian sống và làm cho người bệnh khỏe mạnh hơn. Vì thế, những
người có nguy cơ mắc bệnh nên được tư vấn và kiểm tra HIV ngay sau khi phơi
nhiễm với nguồn bệnh [31]. Trong nhiều trường hợp, sự chẩn đoán một bệnh nhân
có HIV thường được diễn ra nhiều lần (thường xuyên qua các năm).
Bên cạnh sự chẩn đoán cho từng cá nhân, xét nghiệm HIV còn được thực
hiện với một lượng lớn các mẫu máu và các sản phẩm của máu hoặc các cơ quan
ghép để đảm bảo an toàn cho người nhận cũng như để làm giảm nguy cơ bùng phát
thành dịch (UNAIDS, 1997 và 2001) [33, 34].
Trong tình trạng hiểu biết hiện nay, nhiễm HIV coi như là suốt đời mang
HIV. Phát hiện HIV dựa trên 3 nguyên tắc [50, 51, 52].
• Nuôi cấy và phân lập virut
• Phát hiện kháng thể kháng HIV
• Phát hiện trực tiếp kháng nguyên, acid nucleic hoặc protein của virut
1.3.1.1 Phương pháp phân lập và nuôi cấy virut HIV
HIV- 1 có thể được cấy từ huyết tương hoặc từ tiểu cầu đơn nhân của bệnh
nhân. Nếu kết quả cấy là dương tính thì khẳng định ngay là nhiễm HIV. Nhược
điểm của phương pháp này là môi trường nuôi HIV rất phức tạp. Do đó, hầu hết
nuôi cấy virut chỉ sử dụng với mục đích nghiên cứu chứ ít được ứng dụng trong
chẩn đoán.
1.3.1.2 Phương pháp định tính xác định ADN của provirut của HIV-1
bằng kỹ thuật PCR

mục đích này là kháng nguyên lõi capsit p24 – một protein cấu trúc là thành phần
chính của hạt virut. Kháng nguyên này xuất hiện sau khoảng 2 đến 6 tuần với nồng
độ cao trong máu. Do đó, việc kiểm tra kháng nguyên này là phương pháp tối ưu
trong việc chuẩn đoán sớm sự nhiễm HIV-1 [7, 16, 50].
Sau giai đoạn này, nồng độ kháng nguyên giảm do liên kết với kháng thể đặc
hiệu kháng p24 nên không xác định được kháng nguyên trong hầu hết các bệnh
nhân. Vì lí do này mà phương pháp kiểm tra kháng nguyên p24 là không phù hợp để
chẩn đoán sự nhiễm HIV-1 ở người đang ở trạng thái khỏe mạnh nhưng mang HIV1. Trong trường hợp này, người ta phải dùng các biện pháp xét nghiệm khác như
RT- PCR và bADN [35].
Theo dõi kháng nguyên p24 có thể dự đoán được thời kỳ của bệnh do:
19


Luận văn cao học

Hoàng Anh

• Kháng nguyên p24 xuất hiện sớm trong giai đoạn sơ nhiễm ở 50-70%
bệnh nhân
• Khi đến giai đoạn tiềm tan thì p24 giảm dần theo thời gian
• Khi đến giai đoạn AIDS thì lượng p24 tăng trở lại [52]
Các kháng nguyên của HIV thường được xác định bằng các phương pháp
như phương pháp enzym liên kết miễn dịch (ELISA hoặc EIA). Các phiến plastic
được phủ bằng protein của virut (kháng nguyên). Huyết thanh bệnh nhân được đưa
vào giếng. Nếu trong huyếtt thanhh có kháng thể kháng HIV, các kháng nguyên
HIV sẽ liên kết với các kháng thể đặc hiệu trong các phiến. Sau khi rửa huyết thanh,
các kháng thể gắn kết được xác định bằng kháng thể thứ 2, kháng thể này liên kết
với một enzym như alkalin phophataza, hoặc peroxidaza. Sự liên kết giữa kháng thể
thứ 2 với kháng thể kháng HIV có thể xác định được bằng phản ứng của đĩa với cơ
chất của alkalin phophataza hoặc peroxidaza làm chuyển màu khi được phân cắt

này chỉ được sử dụng ở giai đoạn sau của quá trình nhiễm [22]. Do vậy, việc xác
định kháng thể kháng p24 trong giai đoạn này là một lựa chọn để xác định sớm sự
nhiễm HIV [9, 41].
Chẩn đoán kháng thể kháng HIV nhờ phương pháp ELISA có độ nhạy hơn
99%, tuy nhiên cũng có trường hợp dương tính giả. Vì thế, tất cả các mẫu dương
tính trong phản ứng ELISA đều được xác định lần thứ 2 nhờ phương pháp Western
blot. Mặc dù không nhạy như ELISA, phương pháp Western blot đặc hiệu hơn và
cho phép xác định tại phòng thí nghiệm protein đặc hiệu virut phản ứng với kháng
thể [17]. Chỉ có các xét nghiệm dương tính ở cả 2 phản ứng với ELISA và Western
blot mới được kết luận là nhiễm HIV [41, 52].
1.3.1.5 Chẩn đoán nhanh HIV bằng Rapid HIV Test
Bên cạnh phương pháp chuẩn xác định HIV bằng các phương pháp kiểm tra
đã biết, hiện nay đã có phương pháp chẩn đoán nhanh để xác định sự nhiễm HIV
trong phòng thí nghiệm đối với phụ nữ mang thai hoặc đối với bệnh nhân bị thương
(Abbott Laboratories).
Phương pháp này đã được áp dụng trong chẩn đoán nhanh ở các quốc gia
phát triển và nay đã được đưa vào Việt Nam thông qua các hoạt động của các tổ
chức phòng chống AIDS toàn cầu. Chỉ trong 10 phút, sử dụng các hạt latex được
bọc bởi kháng nguyên HIV-1, sau đó được ủ cùng với huyết thanh của bệnh nhân để
cho ra kết quả. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này là hơn 99%. Hiện nay,
phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi và liên tục có sự cải tiến để làm giảm
thời gian xác định bệnh và làm tăng độ nhạy cũng như độ đặc hiệu [48, 51].

1.3.1.6 Chẩn đoán sinh học có suy giảm và rối loạn miễn dịch
- Dấu hiệu trực tiếp và thường xuyên được sử dụng nhất là sự giảm TCD4 +.
Bình thường lượng tế bào này trong máu là 450- 1280/ mm 3; còn với TCD8+ là 258800/mm3.
21


Luận văn cao học


Luận văn cao học

Hoàng Anh

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein P24 tái tổ hợp
Trước vai trò to lớn của việc sử dụng kháng nguyên P24 trong chẩn đoán và
chế tạo vacxin, việc nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp P24 đang thu hút được
nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và cũng thu được những thành tựu đáng kể
[28, 32, 43, 48]. Các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất protein P24 tái tổ hợp để
dùng trong chẩn đoán HIV bằng ELISA hoặc Western blot. Rất nhiều loại kit được
lưu hành trên thị trường để kiểm tra sự nhiễm HIV như kit HIV-1 P24 Extended
Range Kit của hãng Gentaur [44], Bio Rad. Thành công từ việc tối ưu hóa sản xuất
protein tải tổ hợp P24 trong Mycobacterium bovis [27] và trong E. coli [19]. Việc
chuyển gen p24 vào trong cây thuốc là một trong những thành tựu quan trong để
hướng tới việc chế tạo vacxin cho người nhiễm HIV [30]. Có nghiên cứu đã tạo
được gen p24 tái tổ hợp từ nấm men và đã gây miễn dịch thành công cho những
người tình nguyện khỏe mạnh [40]. Ngoài ra, protein P24 tái tổ hợp còn được ứng
dụng trong việc chế tạo kháng thể đơn dòng để dùng trong việc chế tạo các kit chẩn
đoán HIV [36].
Trong giới hạn luận văn này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu việc sản xuất
protein P24 tái tổ hợp dùng trong mục địch phát hiện kháng thể kháng HIV trong
huyết thanh bệnh nhân.
1.5 Vectơ
Một vectơ được sử dụng cho mục đích tách dòng cần có những đặc điểm sau:
• Vectơ phải có khả năng sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc
vào sự sao chép hệ gen tế bào chủ.
• Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng
ADN tối đa. Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ dàng xâm nhập
vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và đạt hiệu quả.

tôi sử dụng vectơ pCR 2.1 của hãng Introgen làm vectơ tách dòng. Đây là một trong
các vectơ đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp
sản phẩm PCR vào vectơ đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có
một bazơ Thimin. Vectơ pCR 2.1 có kích thước 3,9 kb, được thiết kế có gắn một
operon chuyển hoá đường lactoza là operon-lac. Tại vùng ranh giới giữa promotơ
của operon này là gen cấu trúc mã hoá cho β- galactosidase có vùng cắt đa vị với
17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn như EcoRI, HindIII, NsiI, KpnI, SacI, BamHI,
SpeI, BstXI, EcoRV, NotI, AvaI, PaeR7I, XhoI, XbaI, ApaI. Trong đó EcoRI và
BstXI có hai vị trí cắt, các enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt. Với vị trí của vùng
cắt gắn đa vị như vậy, sản phẩm β-galactosidase có thể được tạo ra (nếu vectơ
không được đính đoạn ngoại lai) hoặc không được tạo ra (nếu vectơ được đính đoạn
ngoại lai). Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn được những tế bào mang
vectơ tái tổ hợp với tần suất cao. Ngoài ra, vectơ pCR 2.1 có chứa gen kháng kháng
sinh là ampicillin, nhờ đó có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa
ampicillin với nồng độ ức chế tối thiểu.
24


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Hình 7. Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của Vectơ pCR 2.1
1.5.2 Vecto biểu hiện pVFT2S

Hình 8: Sơ
đồ cấu trúc và
vị trí vắt giới
hạn của vector
pVFT2S