BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIÊP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MINH HƯỜNG

NGHIÊN CỨU, SO SÁNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
TÍCH TẾ BÀO VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
PHÂN TỬ CỦA VIRUS PRRS QUA CÁC ĐỜI CẤY
CHUYỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC- 145

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

HỌC VIỆN NÔNG NGHIÊP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ MINH HƯỜNG

NGHIÊN CỨU, SO SÁNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
TÍCH TẾ BÀO VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
PHÂN TỬ CỦA VIRUS PRRS QUA CÁC ĐỜI CẤY
CHUYỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC- 145


Nông nghiệp Việt Nam, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Cuối cùng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các anh, chị
em phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Khoa Thú y những người luôn động viên,
giúp đỡ tôi để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Minh Hường

iii


MỤC LỤC
Lời cam đoan...................................................................................................... ii
Lời cảm ơn ........................................................................................................ iii
Mục lục ............................................................................................................ iv
Danh mục các từ viết tắt ................................................................................... vi
Danh mục bảng ................................................................................................ vii
Danh mục hình ............................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................. 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Lịch sử và tình hình dịch bệnh PRRS ở lợn.................................................. 3
1.1.1. Tình hình dịch PRRS trên thế giới...................................................... 3
1.1.2. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam .................................................... 6
1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS) ............................................. 7
1.2.1. Căn bệnh. ........................................................................................... 7

3.3. Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của virus PRRS qua các đời cấy
chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 .................................................. 45
3.3.1. Kết quả phản ứng RT – PCR ............................................................ 45
3.3.2. Kết quả giải trình tự gen ở các đời cấy chuyển ................................ 46
3.3.3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của từng chủng virus PRRS
ở các đời cấy chuyển ....................................................................... 48
3.3.4. Sự tương đồng về nucleotide của đoạn gene ORF5 của các
chủng PRRSV ở các đời nghiên cứu ................................................. 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 55
1. Kết luận ........................................................................................................ 55
2. Kiến Nghị ..................................................................................................... 55

v


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Aa

: acid amin

BED

:Blue Ear disease

CNSH

: Công nghệ sinh học

CPE


LDHV

: Lactate Dehydlogenase – elevating virus

MA

: Monkey kidney cell

MSD

: Mistery Swine Disease

OIE

: Tổ chức thú y thế giới

ORF

: Open reading frame (khung đọc mở)

PAM

: Pulmnary alveolar macrophage

PEARS

: Porcine Endemic Abortion and Respiratory syndrome

PRRS


Sức đề kháng của PRRSV ...................................................................... 11

2.1

Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR ...................................... 31

2.2

Các cặp mồi cho phản ứng RT - PCR .................................................... 32

3.1

Hồ sơ mẫu các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu ......................... 36

3.2

Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus nghiên cứu ............. 37

3.3

Mức độ tương đồng về nucleotide của các chủng PRRS nghiên cứu (%) ........... 42

3.4

Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus qua các đời ............. 45

3.5

Mức độ tương đồng về nucleotide giữa các đời nghiên cứu của

1.3

Hình thái virus PRRS ............................................................................... 8

1.4

Cấu trúc bộ gen của PRRSV .................................................................... 8

1.5

Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào ........................... 14

1.6

Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR ............................................ 20

3.1

Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus ................................................. 38

3.2

Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm ................................................... 38

3.3

Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm ................................................... 38

3.4


chuyển ................................................................................................... 51

viii


MỞ ĐẦU

1.1.

Tính cấp thiết của đề tài
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome – PRRS) hay còn gọi bệnh “Tai xanh” là một bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn với mọi nòi giống, lứa tuổi và có những diễn
biến phức tạp, xảy ra nghiêm trọng và gây nhiều thiệt hại nặng nề.
Virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế và ít biểu hiện triệu chứng,
tỷ lệ mắc bệnh cao. Ở lợn nái, bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục,
gia tăng số thai chết và lợn con sơ sinh yếu, lợn con chết trước khi sinh, còi cọc,
chậm lớn. Các lợn sau cai sữa, lợn choai bị mắc PRRS có biểu hiện bỏ ăn, chán
ăn, sốt cao, da mẩn đỏ, khó thở. Lợn đực giống khi bị nhiễm bệnh thường bỏ ăn,
sốt cao, đờ đẫn hoặc hôn mê, một số con có hiện tượng tai chuyển thành màu tím,
viêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất
lượng kém.
Hiện nay đã có vacxin, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng
bảo hộ cho đàn lợn của các sản phẩm vacxin PRRS thương mại. Bên cạnh đó đã
có nhiều nghiên cứu cho thấy virus PRRS có sự đột biến cao, tạo ra nhiều chủng
có độc lực khác nhau gây khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh.
Trong những năm gần đây, nước ta đã có nhiều loại vacxin nhập ngoại tuy
nhiên dịch bệnh vẫn xảy ra. Vì vây, để chủ động đạt hiệu quả cao trong công tác
phòng chống dịch PRRS, Việt Nam cần có vacxin chế từ các chủng phân lập được.

Anh năm 1991 và năm 1992 ở Pháp (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ,
2007).
Năm 1998, bệnh được phát hiện ở châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản. Thời
gian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên có nhiều tên gọi: Bệnh bí hiểm
ở lợn (Mistery swine disease – MDS); bệnh tai xanh (Blue Ear disease – BED);
hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (Porcine Endemic abortion and Respiratory
syndrome – PEARS)…
Năm 1992, Hội nghị Quốc tế về hội chứng này được tổ chức tại
Minesota (Mỹ), Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine respiratory and reproductive
syndrome - PRRS).
Theo Cục Thú y (2008), từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh
thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đều có dịch PRRS lưu hành (trừ Châu
Úc và Newzeland). Có thể khẳng định rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất
kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Bá Hiên
và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007).

3


Hình 1.1. Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao ở châu Á
Từ năm 2006 đến năm 2010
(2006 màu đỏ, 2007 màu hồng, 2009 màu xanh, 2010 màu xanh nhạt).
Tại Trung Quốc, theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia
của Trung Quốc được phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợn của
Trung Quốc đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi Hội chứng sốt cao ở lợn do nhiều
nguyên nhân, trong đó chủ yếu là virus PRRS và các loại mầm bệnh khác gồm:
Virus Dịch tả lợn, PCV-2 chiếm 96,5%...Trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006,

4



1.1.2. Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam
Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đàn
lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam. Kết quả kiểm tra 51 con cho thấy 10/51
lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRSV. Toàn bộ số lợn này
đã được xử lý ngay sau đó. Những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh ở các
trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính
với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% (Hoàng Văn Năm, 2001).
Như vậy có thể thấy virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta
trong một thời gian dài. Sự bùng phát dịch đầu tiên gây tổn thất cho ngành chăn
nuôi bắt đầu từ tháng 3/2007. Dịch xuất hiện từng đợt tại cả 3 miền Bắc, Trung,
Nam gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là ảnh hưởng đến
phát triển đàn giống tổng số con ốm và mắc bệnh ở đợt dịch này là 31.750 con,
số con chết và đem xử lý là 7.296 con. Dịch PRRS diễn biến phức tạp, xảy ra
trầm trọng, làm thiệt hại nặng nề cho nghành chăn nuôi lợn ở các năm tiếp sau
đó là vào các năm 2008 tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con và số lợn chết
buộc phải tiêu hủy là 300.906 con, 2009 với 7.030 con lợn mắc bệnh và phải
tiêu hủy 5.847 con, 2010 Tổng số lợn trong đàn mắc bệnh là 970.857con, số
mắc bệnh là 717.830 con, trong đó số chết và tiêu hủy là 413.540 con. Theo
nhận định của cục thú y dịch có xu hướng diễn biến phức tạp và khó lường gây
thiệt hại cho đàn lợn cũng rất nặng nề , năm 2011 Tổng số lợn mắc bệnh là
14.704 con, số con chết và tiêu hủy là 13.831 con, 2012 với tổng số lợn mắc
bệnh là gần 6000 con, 2013 Cục Thú y cũng nhận định dịch tai xanh năm 2013
có diễn biến bất thường hơn so với năm 2012, tốc độ lây lan rất nhanh, số lượng
lợn mắc bệnh phải tiêu hủy cao, tỷ lệ lợn chết và lợn tiêu hủy đã lên đến 18.452
con. Trong năm 2014 và tính đến tháng 8/2015 cả nước không có tỉnh nào xuất
hiện và công bố dịch hiện tại cả nước không có dịch (theo Cục Thú y).

6

Hình1.2. Dịch bệnh PRRS tại Việt Nam năm 2007
Nguồn: Cục thú y
1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS)
1.2.1. Căn bệnh.
1.2.1.1. Hình thái và cấu trúc của virus PRRS
Virus PRRS là một virus ARN chuỗi đơn dương, virus được xếp vào bộ
Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus(Collins JE, 1992). Virus có cấu trúc
gần giống với virus gây viêm khớp ở Ngựa (EAV), Lactic dehydrogennase virus của
chuột (LDHV) và virus gây xuất huyết trên khỉ (SHFV) (Rossow KD và cs, 1998).
Quan sát virus dưới kính hiển vi điện tử thấy virus có dạng hình cầu, có vỏ
bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45nm – 80nm và chứa nhân
nucleocapxit kích thước 25nm – 35nm (William T.Christianson, 2000).

7


Hình 1.3. Hình thái virus PRRS
Đây là ARN virus với bộ
gen là một phân tử ARN
sợi đơn dương. Sợi ARN
này có kích thước khoảng
15 kilobase, có 9 khung
đọc mở (ORF − open
reading frame) mã hoá
cho 9 protein cấu trúc.

Hình 1.4. Cấu trúc bộ gen của PRRSV
Tuy nhiên trong cấu trúc của virus PRRS, có 6 phân tử protein chính có
khả năng trung hoà kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein (
GP1,GP2,GP3,GP4,GP5), 1 phân tử protein màng (M) và 1 protein vỏ nhân virus


ORF 2
Là protein liên kết vỏ bọc kết hợp

GP 5

25 kDa

ORF 5

glycogen có tính bám dính tế bào
đa dạng nhất

M

19 kDa

ORF 6

N

19 kDa

ORF 7

Là protein liên kết vỏ bọc có tính
bảo tồn cao nhất
Là protein vỏ bọc nhân có tính
kháng nguyên cao


Chủng Châu Âu có 2 subtype: I10 phân lập tại Hà Lan và Oloot tại Tây Ban Nha.
Chính sự khác biệt về tính đa dạng và tính kháng nguyên, khả năng biến đổi cấu
trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxine
chống lại chúng (Nguyễn Thị Hoa, 2010).
1.2.1.3. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS
* Khả năng gây bệnh:
Virus PRRS chỉ gây bệnh cho lợn. Lợn tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm,
nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả. Loài lợn rừng cũng
mắc bệnh, đây có thể coi là nguồn dịch bệnh thiên nhiên.
Về mặt độc lực virus PRRS được 2 dạng:
+ Dạng cổ điển: Có độc lực thấp, ở dạng này khi mắc bệnh thì có tỷ lệ
chết thấp, chỉ từ 1-5% trong tổng đàn.
+ Dạng biến thể độc lực cao: Gây nhiễm và chết nhiều lợn.
Thông thường virus chỉ gây bệnh cho lợn, không gây bệnh cho người và
động vật khác. Tuy nhiên, một số loài thủy cầm chân màng, vịt trời đã được
chứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS, và virus có thể nhân lên ở loài vịt
này, do đó vấn đề phát tán virus ra diện rộng là khó tránh khỏi (Zimmerman và
cs.1997).
* Sức đề kháng:
Virus có sức đề kháng yếu với điều kiện ngoại cảnh.

10


Bảng 1.2. Sức đề kháng của PRRSV
Điều kiện môi trường

Khả năng đề kháng

Virus trong bệnh phẩm

Đề kháng kém

Virus trong huyết thanh
72h ở 250C

Vẫn phát hiện được virus

72h ở 40C hoặc – 200 C

Vẫn phát hiện được virus

Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu
diệt virus. Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng.
1.2.1.4. Đặc tính nuôi cấy virus PRRS.
Virus PRRS có thể nhân lên trên hai loại môi trường tế bào là đại thực bào
phế nang (PAM - Pulmnary Alveolar Macrophage) và tế bào dòng tế bào thận
khỉ Châu Phi (MA - Monkey kidney cell).
PAM là môi trường rất tốt cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất,
virus có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virus
PRRS trên thế giới. Nhưng nhược điểm của nó là phải chuẩn bị môi trường từ
những con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên
của tế bào là có giới hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài
(Kim và cs, 1993).
Với môi trường là các tế bào dòng như: MA-104, Marc-145, CL-2621 hiện
đang được sử dụng nhiều hơn và khắc phục được nhược điểm của tế bào PAM.

11


MA-104 chỉ có thể phân lập được các chủng virus của Bắc Mỹ. CL-2621 có thể

* Phương thức truyền lây:
Bệnh có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn mắc bệnh, lợn
mang trùng với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị
nhiễm virus như phân, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi ...
Bệnh lây chủ yếu qua đường hô hấp, qua thụ tinh nhân tạo, tiếp xúc trực
tiếp. Ở lợn mẹ mang trùng virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn kỳ
giữa trở đi và virus cũng được bài xuất qua nước bọt và sữa. Lợn trưởng thành có
thể bài xuất virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai bài xuất
virus trong thời gian 1 − 2 tháng.
Virus có thể được phát tán thông qua con đường vận chuyển lợn mang
trùng theo gió có thể đi xa tới 3km, bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi, dụng cụ
bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể phát tán nhờ một số loài
chim hoang dã.
1.2.2.3. Cơ chế sinh bệnh
Sau khi xâm nhập, đích tấn công của virus PRRS là các đại thực bào. Đây
là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ
và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó. Một tỷ lệ lớn
tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhiễm rất sớm.
Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng
quan trọng trong đáp ứng miễn dịch kể cả đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là
loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu, mở đầu cho quá trình đáp ứng
miễn dịch đặc hiệu. Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng
miễn dịch không xảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm
miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát (Nguyễn Bá Hiên và
Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007).

13


Hình: PRRS xâm nhiễm: các đại thực bào với các ”chân giả” có tác dụng bắt giữ

sinh vật khác.
Triệu chứng lâm sàng được thể hiện rất khác nhau, theo ước tính cứ 3 đàn lần
đầu tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện, một đàn có biểu hiện
mức độ vừa và một đàn biểu hiện ở mức độ nặng. Lý do của việc này đến nay
vẫn chưa có lời giải thích. Tuy nhiên, với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh
cũng giảm nhẹ hơn và cũng có thể virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác
nhau. Thực tế, nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có dấu hiệu
lâm sàng (Nguyễn Văn Thanh, 2007).

• Ở lợn nái
Trong tháng đầu tiên khi bị nhiễm bệnh lợn biếng ăn, sốt 40-410C, một số con
tai chuyển màu tím trong thời gian ngắn, tím đuôi, tím âm hộ, sảy thai ở giai
đoạn đầu. Lợn nái trong giai đoạn nuôi con thường biếng ăn, lười uống nước,
viêm vú, mất sữa, động dục lẫn lộn (5-10 ngày sau khi sinh) nái chậm lên giống
nếu bệnh kéo dài sẽ kế phát nhiều bệnh ghép và dẫn đến tử vong (Murakami Y,

15


1994). Đỉnh cao của bệnh là hiện tượng sảy thai, đẻ non, thai chết lưu, thai gỗ
hàng loạt. Lợn con đẻ ra yếu ớt tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%.

• Lợn đực giống
Khi bị nhiễm bệnh lợn thường bỏ ăn, sốt cao, đờ đẫn hoặc hôn mê, một số
con có hiện tượng tai chuyển thành màu tím. Đặc biệt xuất hiện hiện tượng viêm
dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh
kém. Lợn đực giống rất lâu mới hồi phục được khả năng sinh sản.

• Lợn con theo mẹ
Thể trạng gầy yếu, lợn nhanh chóng rơi vào tình trạng tụt đường huyết do