WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ LUYẾN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM
QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG
KỸ THUẬT LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ LUYẾN

quá trình thực nghiệm.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã
luôn động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 năm 2014
Tác giả

Bùi Thị Luyến

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

MỤC LỤC
CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Đặt vấn đề ..................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN...........................................................................................1
1.1. Vài nét về Quinolon.............................................................................................3
1.1.1. Cấu tạo chung.....................................................................................................3
1.1.2. Phân loại ............................................................................................................3
1.1.3. Cơ chế tác dụng..................................................................................................3
1.1.4. Tác dụng phụ ................................................................................................... 3
1.1.5. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu ................................................................4
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc
ký ...............................................................................................................................5
1.3. Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ............................................12
1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ................................................12
1.3.2. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước ..................13

3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .................................................................35
3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................................39
3.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp.........................................................39
3.4. Phân tích trên mẫu thực nghiệm ......................................................................44
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật ............................................................................46
4.1.1. Các điều kiện phân tích trên hệ thống LC-MS/MS............................................46
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu .........................................................................................47
4.2. Thẩm định quy trình đã xây dựng...................................................................47
Kết luận ...................................................................................................................50
Kiến nghị .................................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
HPLC

Tiếng Anh

Tiếng Việt

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chiết pha rắn

ESI

Electrospray ionization

EU

European Union

APCI

AOAC
IS

Điện di mao quản
Ion hóa phun điện tử
Liên minh Châu Âu

Atmospheric pressure chemical

ion hoá hoá học áp suất khí

ionization

quyển

Association of Official Analytical.

Hiệp hội các nhà hoá phân tích

Part per billion

Phần tỷ

Ppm

Part per million

Phần triệu

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số 2377/90/EC của
Ủy ban Châu Âu……………………………………………………….…………...…15
Bảng 1.2 : Danh mục các quinolone hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy
sản..………………………………...…………………………………...….………….16
Bảng 3.1. Thông số chung của detector khối phổ…………...........................………..27
Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon………………………...…………………27
Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry……………….…...……….28
Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột Xbridge………...……………….....…..28
Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin……....29
Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Ciprofloxacin….....30
Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Enrofloxacin......…30
Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Flumequin.…...….30
Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin………......……….31
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Ciprofloxacin……...….……..32


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon ..………………………………… …….3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin ………………..……………………...4
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin ……….………….…….……..……….5
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Norfloxacin ….……………………………………..5
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Flumequin …….……………………………………5
Hình 3.1: Sắc ký đồ thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích norfloxacin……..29
Hình 3.2: Sắc ký đồ thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin…………………32

Hình 3.3: Sắc ký đồ khi phân tích tính thích hợp của hệ thống………………..….35
Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn của Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (phải)……….36
Hình 3.5: Sắc ký đồ khi xây dựng đường chuẩn của norfloxacin…………………….37
Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn của Enrofloxacin (trái) và Flumequin (phải)…..……..38
Hình 3.7: sắc ký đồ của norfloxacin khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB …………….....40
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu thực tế có (hoặc không có) norfloxacin………………..45

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

ĐẶT VẤN ĐỀ
An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ
sức khoẻ con người. Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh
(trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến
bộ của công nghệ sinh học. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung
và nhóm Fluoroquinolon nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho con
người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh, người sử dụng loại thực phẩm này


cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon. Bộ Thủy sản đã ra quyết định số
07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005 quy định danh mục 17 loại kháng sinh
cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong đó có nhóm Quinolon [10]
và Quyết định số 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ sung nhóm
Quinolon vào danh mục cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu
vào thị trường Bắc Mỹ và Hoa Kỳ [11].
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình xác định dư lượng một
số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC-MS/MS”, với 2 mục tiêu
chính như sau:
1. Xây dựng quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin ,
flumequin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép 2 lần khổi phổ LC-MS/MS.
2. Ứng dụng quy trình đã xây dựng để sơ bộ khảo sát dư lượng Quinolon trong một
số loại thực phẩm (Thịt, cá) trên thị trường Hà Nội.

2

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về Quinolon [5]
1.1.1. Cấu tạo chung
Đôi khi ở vị trí 8 là N. Vậy đa số chúng là dẫn chất của acid 1,4-dihydro-4oxo-quinolein-3-carboxylic.
O
COOH

R1

+ Trên các vi khuẩn gram (+) thì đặc biệt là tụ cầu vàng, S.epidermitis đã kháng
gentamycin, liên cầu, cầu khuẩn ruột (Enterococus) và các vi khuẩn kỵ khí.
+ Trên các vi khuẩn phát triển trong tế bào, và một số loại vi khuẩn đặc biệt nguy
hiểm (như Legionella, Chlamydia, Ureoplasma, Mycoplasma, các vi khuẩn kháng
alcol...)
1.1.3. Cơ chế tác dụng
Theo một hoặc hai cơ chế sau và đều cho tác dụng diệt khuẩn:
- Ức chế ADN-gyrase, là enzym tham gia vào quá trình tổng hợp acid nhân.
- Tạo phức với kim loại hóa trị hai của các protein chứa các kim loại này, đồng thời
phức đó ion hóa thành ion phức có hoạt tính cao với các enzym chuyển hóa
1.1.4. Tác dụng phụ
Tác dụng phụ của thuốc chủ yếu là lên dạ dày - ruột, thần kinh trung ương và da.
- Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, ỉa chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hoá

3

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

- Da: Nổi ban, ngứa, viêm tĩnh mạch nông.
- Cơ xương: Ðau ở các khớp, sưng khớp. Ðau cơ, viêm gân (gân gót) và mô bao
quanh. Có một vài trường hợp bị đứt gân, đặc biệt là ở người cao tuổi khi dùng phối
hợp với corticosteroid.
- Thần kinh trung ương: Cơn co giật, lú lẫn, rối loạn tâm thần, hoang tưởng, mất
ngủ, trầm cảm, loạn cảm ngoại vi, rối loạn thị giác kể cả ảo giác, rối loạn thính giác,
ù tai, rối loạn vị giác và khứu giác, tăng áp lực nội sọ.
- Da: Hội chứng da - niêm mạc, viêm mạch, hội chứng Lyell, ban đỏ da thành nốt,
ban đỏ đa dạng tiết dịch.

Enrofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi
khuẩn gram dương và gram âm.

4

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Tên gọi: acid 1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo3-quinolinecarboxylic.
Công thức hóa học: C19H22FN3O3

N

H3C

N

Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 219-2210C

N

F

COOH
O

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin

Tính chất: Bột trắng, không tan trong nước, ít tan trong methylen chlorid, rất
ít tan trong methanol, dễ tan trong kiềm
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
[2], [7]
Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố
của các chất tan giữa hai pha khác nhau (pha động, pha tĩnh). Dung dịch các chất

5

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

phân tích khi vào cột sẽ được hấp thụ hay liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản
chất của cột và của chất cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với một tốc độ
nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo
bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi mà quá trình
rửa giải tách được các chất ra khỏi nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát
hiện bởi detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được đưa
ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp
nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì
hỗn hợp có bao nhiêu thành phần thì sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ.

1.2.1. Kết nối sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với phổ khối lượng (MS)
Trong nhiều quá trình phân tích, các hợp chất quan tâm thường nằm trong
một hỗn hợp phức tạp, và vai trò của kỹ thuật sắc ký là thiết lập sự tách các thành
phần của hỗn hợp, cho phép định tính hoặc định lượng chúng. Về mặt định tính,
nhược điểm chính của kỹ thuật sắc ký trong quá trình tách là không có khả năng
cung cấp thông tin về định tính một cách rõ ràng cho các hợp phần mẫu, thậm chí cả

vào mức độ phức tạp của hỗn hợp mẫu và bản chất của mỗi thành phần trong hỗn
hợp. Công việc này nếu chỉ riêng phép sắc ký thôi thì không thể thực hiện được.
Phương pháp sắc ký
- Là phương pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu.
- Nhận dạng các mẫu dựa trên thời gian lưu.
- Cho phép phân tích định tính và định lượng.
- Phân lập và tinh chế chất.
Phương pháp phổ khối lượng
- Là phương pháp nhận dạng các lượng mẫu nhỏ.
- Cung cấp phổ khối lượng của các hỗn hợp phức tạp.
Sự kết hợp của HPLC và phổ khối lượng vì thế cho phép nhận dạng rõ ràng và xác định
số lượng của các hợp chất mà phương pháp sắc ký không phân tích đầy đủ được.
1.2.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng - khối phổ
Một máy sắc ký lỏng khối phổ bao gồm 3 bộ phận chính (hình 1.1).
- Thiết bị sắc ký lỏng (LC, Liquid Chromatography): thông thường sử dụng máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, High Performance Liquid Chromatography),
hiện đại hơn là máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC – Ultra Performance Liquid
Chromatography)
- Bộ kết nối (Interface): có nhiệm vụ loại dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào
buồng ion hoá của máy phổ khối. Đây là bộ phận rất quan trọng và là chìa khoá của
phương pháp LC-MS.

7

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

- Thiết bị phổ khối lượng (MS, Mass Spectrometry).

Khối phổ

Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ
Bộ phận kết nối (interface) ở đây đóng vai trò quan trọng vì nó là kỹ thuật
chìa khoá của một máy sắc ký lỏng - khối phổ. Chức năng của bộ kết nối là loại
dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào buồng ion hóa của máy khối phổ. Bộ kết
nối bao gồm nhiều loại khác nhau và ra đời ở các thời điểm khác nhau như:
- Bộ kết nối băng chuyền (Moving Belt Interface): 1977.
- Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (DLI, Direct Liquid Introduction Interface):
1980
- Bộ kết nối phun nhiệt (Thermospray Interface): 1983
- Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA, Continuous Flow
Fast Atom Bombardment Interface): 1985/1986.
- Bộ kết nối ion hoá hoá học áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric-Pressure
Chemical Ionization Interface): 1986.
- Bộ kết nối ion hóa phun điện (ESI, Electrospray Ionization Interface): 1988.
1.2.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Phương pháp phổ khối lượng là một trong những phương pháp phân tích
công cụ quan trọng. Phổ khối lượng cung cấp các thông tin về phân tích định tính,
định lượng các nguyên tố, thành phần và cấu trúc của các hợp chất vô cơ và hữu cơ.
a. Nguyên tắc chung của phương pháp
Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự
bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hoà thành ion phân tử mang điện tích

8

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như:
lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung
siêu âm, vi sóng.... nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các
tiêu chí:
- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc.
- Tăng nồng độ lên nhiều lần.
- Lượng mẫu không cần nhiều.
- Lượng dung môi cần ít.
- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu.
- Đơn giản, nhanh, giá thành thấp.
Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời
gian... mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất.
a. Chiết lỏng - lỏng
Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng,
dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao. Quá trình chiết lỏng lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ
phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một
hằng số.

10

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

KA =

[Ahc ]
[An ]



WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu có thể được sử dụng để phân tích tồn dư kháng
sinh trong các nền mẫu khác nhau. Hai kỹ thuật phổ biến được sử dụng trên thế giới
và Việt Nam là kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và kỹ thuật chiết pha rắn. Các nền mẫu
trong nghiên cứu là các thực phẩm (chủ yếu là thịt và nội tạng động vật) và thức ăn
chăn nuôi, đây là nền mẫu khá phức tạp nên thường phải sử dụng phối hợp nhiều kỹ
thuật xử lý mẫu để đạt hiệu quả cao. Căn cứ vào các tài liệu tham khảo chúng tôi
cần phân tích và tìm ra những ưu điểm của các nghiên cứu khác nhau về các kỹ
thuật xử lý mẫu với các đối tượng khác nhau và các kỹ thuật phân tích trên các loại
hiết bị khác nhau nhằm xây dựng được quy trình kỹ thuật xác định dư lượng kháng
sinh nhóm Quinolon trong thực phẩm phù hợp với điều kiện Việt Nam.
1.3. Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm
1.3.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
Trong những năm gần đây, kháng sinh được sử dụng nhiều trong lĩnh vực nông
nghiệp đặc biệt là chăn nuôi. Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng
lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (qui
theo mức 100% tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong
dân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong
đó, tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicillin (9%); tetracycline
(66%); macrolid (12%); Aminoglycosid (4%); Fluoroquinolon (1%); Trimethomprim
/sulphamid (2%) và các kháng sinh khác (6%) [24].
Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng tràn lan
trong thức ăn cho vật nuôi và tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt là phổ biến. Các
nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý
từ đó dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm cao gấp hàng chục tới hàng

các cơ sở sử dụng không hợp lý phát hiện 42 (60%) mẫu thịt có tồn dư với các loại kháng
sinh: enrofloxacin, norfloxacin,

tylosin, tetracyclin,

sulfadimidin, sulfadiazin,

sulfaquinoxalin. Có mối liên quan giữa việc ngưng thuốc không đúng qui định với tình
trạng tồn dư kháng sinh. 35,71% mẫu thịt gà có tồn dư vượt quá giới hạn từ 2 – 400 lần
so với tiêu chuẩn của Malaysia [1].
Trong các loại kháng sinh dùng cho chăn nuôi trên thị trường không ít loại không
đảm bảo hàm lượng và chất lượng nên khi sử dụng chúng sẽ có ít hiệu quả. Người chăn
nuôi thường phải dùng kết hợp nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng và chữa bệnh.
Do đó đã gây nên hiện tượng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật như : thịt , sữa ,
trứng... Điều này gây nguy hại lớn cho sức khỏe cộng đồng. Con người sẽ bị nhiễm vi
khuẩn kháng thuốc khi ăn phải thịt nhiễm khuẩn. Đặc biệt là sự kháng thuốc của nhiều
lọai vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm.
1.3.2. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước
Phạm Kim Đăng và đồng sự “ Ứng dụng phương pháp Elisa để phân tích tồn dư
kháng sinh nhóm quinolon trong Tôm tại một số ven biển khu vực phía bắc” cho thấy:
Tình hình tồn dư quinolon trong tôm đã được đánh giá thông qua việc phân tích 90 mẫu
tôm được lấy ở 4 địa phương đại diện (Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định, Nghệ An) bằng
phương pháp ELISA và khẳng định bằng phương pháp Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LCMS/MS). Kết quả phân tích

đánh giá tình hình tồn dư phát hiện 5 quinolon

(enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin và acid oxolinic) trong 9 mẫu
nhiễm (tỷ lệ nhiễm 10%) với nồng độ dao động từ 0,4 đến 145 ppb. Trong đó, có 4 mẫu
nhiễm ở nồng độ cao hơn giới hạn tồn dư cho phép theo Nghị định 2377/90 CE của Uỷ
ban Châu Âu [4].

giới hạn định lượng 2ppb. Các điều kiện sắc ký đã được tối ưu hóa: sử dụng cột C18
(150 mm x 3mm; 3,0μm), Pha động chạy sắc ký là acetonitril và nước được điều
chỉnh đến pH đạt 2,5 bằng axit formic. Thể tích tiêm mẫu 20μl, tốc độ dòng
500μl/phút, nhiệt độ cột: 250C, nhiệt độ nguồn 4500C [8].
1.3.3. Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu xác định dư lượng của các
kháng sinh nói chung và quinolon nói riêng trên các nền mẫu khác nhau. Một số
phương pháp đang được sử dụng như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) [4];
phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật học), phương pháp lý hóa. Mỗi phương
pháp có ưu nhược điểm riêng. Với nhóm quinolon, có thể nhận thấy, phương pháp
được sử dụng phổ biến hiện nay là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do có độ
chính xác cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm.
Các detector được sử dụng nhiều nhất là detector UV [19], detector huỳnh
quang[19], [26], [34] và detector khối phổ [13]…[22]…[41].

14

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Để xác định tồn dư kháng sinh cần phải trải qua quá trình tách chiết
lấy chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu, sau đó được làm sạch và làm giầu sử dụng
bằng các kỹ thuật hiện đại để phát hiện và định lượng.
Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu có thể được sử dụng để phân tích tồn dư kháng
sinh trong các nền mẫu khác nhau. Nguyên tắc chung của quá trình này là kết tủa
protein trong mẫu sử dụng dung môi thích hợp để chiết được chất phân tích, sau đó
được làm sạch và/hoặc làm giàu mẫu trước khi đem đi phân tích. Dung môi được sử
dụng chủ yếu là acetonitril [13], [14]...[21], [30]….[41] hoặc hỗn hợp acetonitril:


bước tiến vượt bậc. Sắc ký lỏng ghép nối với detector khối phổ có độ nhạy và tính
đặc hiệu rất cao, đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe của thế giới về phân tích
dư lượng.
Ngoài kỹ thuật sắc ký lỏng, một số tác giả cũng đã nghiên cứu phát triển
phân tích dư lượng kháng sinh sử dụng kỹ thuật: điện di mao quản (CE). Gần đây,
phương pháp CE được sử dụng do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian
tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp này được D. Barrón sử dụng với
detector PAD để phân tích flumequin và acid oxolinic. Các điều kiện điện di gồm:
dung dịch điện di là dung dịch acid phosphoric 40mM điều chỉnh pH 8,02 bằng
NaOH, thế điện di 18kV, nhiệt độ mao quản duy trì ở 250C, bước sóng phát hiện là
250nm. Phương pháp có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho acid oxolinic
và flumequine tương ứng là 15 và 48ppb và 10 và 30ppb [20]. Tuy nhiên do độ
nhạy không tốt và độ tin cậy không cao nên phương pháp điện di mao quản ít được
áp dụng.
1.3.4. Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm
EU đã ban hành quyết định số 2377/90/EC quy định qui định giới hạn cho phép
thuốc thú y trong sản phẩm động vật, theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động
vật phải được kiểm soát dư lượng tuân thủ qui trình của Chỉ thị số 96/23 EC (EU,
1996). Đặc biệt các phương pháp phân tích được công nhận và áp dụng trong chiến
lược kiểm soát dư lượng phải chuẩn hoá theo quyết định số 2002/657/CE (CE,
2002). Trong đó, quy định về giới hạn tồn dư tối đa của các quinolon trong nghiên
cứu cụ thể như sau.
Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số
2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [22]
Hoạt chất

Danofloxacin

Định lượng

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON