tên đề tài.txt
Phân lập định danh chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế
giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay
Giảng viên hướng dẫn: TS. Hoàng Quốc Khánh
Lớp: 13DSH06
MSSV: 1311100548

Page 1


LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này
là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự hướng
dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh, HVCH.Ngô Đức Duy. Các số liệu và kết quả nghiên
cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được
công bố trước đây. Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn các
nguồn tài liệu trong báo cáo và tài liệu tham khảo.
Mọi sao chép không hợp lệ, không trung thực và vi phạm quy chế nhà trường,
người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công Nghệ Sinh Học
– Thực Phẩm – Môi Trường, trước ban giám hiệu trường Đại Học Công Nghệ
TP.HCM.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 7 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Như

Trương Bích Như


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp
đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin

1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

2.

Tình hình nghiên cứu .......................................................................................... 1

3.

Mục đích nghiên cứu .......................................................................................... 3

4.

Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................... 3

5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 3

6.

Các kết quả đạt được của đề tài .......................................................................... 3

7.

Kết cấu của đồ án tốt nghiệp .............................................................................. 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5
1.1


1.5.1

Các phương pháp ly trích DNA ................................................................. 13

1.5.2

PCR trong định danh vi sinh vật ................................................................ 14

1.5.3

Xây dựng cây phát sinh loài ...................................................................... 16

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18
i


Đồ Án Tốt Nghiệp

2.1

Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 18

2.2

Vật liệu, thiết bị và hóa chất ............................................................................. 18

2.2.1

Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 18


Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase ...................................................... 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 28
3.1

Kết quả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử ............................... 28

3.2

Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS ................................................. 35

3.2.1

Kết quả ly trích thu nhận bộ gen DNA ...................................................... 36

3.2.2

Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS của nấm mốc ............................. 36

3.3 Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng CM1, CDN và CSG và thiết lập
cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI ........................................... 37
3.3.1

Trình tự vùng gen ITS của các chủng CM1, CDN VÀ CSG .................... 37

3.3.2

Thiết lập cây phát sinh loài ........................................................................ 38


PHỤ LỤC B: Kết quả cấy phân lập nấm ban đầu ....................................................... 2
PHỤ LỤC C: Kết quả vùng gen bảo tồn ITS ............................................................... 3
PHỤ LỤC D: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI ................ 6

iii


Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

EDTA

Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid

ITS

Internal transcribed spacer

PCR

Polymerase Chain Reation


Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành.............................................................. 10
Bảng 1.6 Thành phần hóa học của chao ....................................................................... 11
Bảng 2.1 Danh sách các mẫu chao được thu tại TP.HCM, Long An và Đồng Nai ..... 18
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR ......................................................................... 25

v


Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Sơ đồ của các gen ribosome nằm trong vùng gen ITS .................................. 16
Hình 3.1 Khuẩn lạc, tế bào của chủng CTP trên môi trường PDA trong 72 giờ ......... 28
Hình 3.2 Chủng CM2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ ............... 29
Hình 3.3 Chủng CVP2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng ở 72 giờ ................... 30
Hình 3.4 Chủng CVP1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ ............. 31
Hình 3.5 Mẫu CM1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. ................. 32
Hình 3.6 Mẫu CDN trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ .................. 33
Hình 3.7 Mẫu CSG trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ ................... 34
Hình 3.8 Kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng CM1,CDN và CSG trên gel
agarose 1,5%. ................................................................................................................ 36
Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng CM1, CDN và CSG trên gel
agarose 1,5% ................ ................................................................................................ 37
Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng CM1,
CDN và SGN với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI ....................................... 40
Hình 3.11 Khả năng sinh caseinase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG ............... 41
Hình 3.12 Kết quả sinh enzyme lipase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG ........... 42
Hình 3.13 Khảo sát khả năng lên mốc chao của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG ... 42

vi

được công bố. Năm 1929, Wai là người đầu tiên đã phân lập một loại mốc thuộc dòng
1


Đồ Án Tốt Nghiệp

Mucor và đặt tên là Mucor sufu (mốc chao)[17]. Năm 2011, Nguyễn Văn Thành và
Trần Nguyễn Ngọc Quỳnh đã nghiên cứu về sản xuất tối ưu bột bào tử nấm
Actinomucor elegans để ứng dụng vào quy trình sản xuất chao. Kết quả cho thấy mật
độ bào tử nấm đạt cao nhất (1010 bào tử /g cơ chất khô) với nghiệm thức 17 sử dụng cơ
chất tấm cám (2:1), chủng 105 bào tử/ gck thu hoạch sau 7 ngày ủ 300C. Sau 5 tháng
bảo quản mật độ bào tử duy trì sức sống cao ở nhiệt độ 40C (trong tủ lạnh). Trong khi
đó các nghiệm thức trong phòng hoặc trong bình hút ẩm 250C duy trì sức sống thấp
hơn và tương đương nhau [11].
Năm 2012, Lê Minh Nguyệt và Phan Thị Phương Thảo đã tiến hành xác định
được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tạo thành bào tử và sinh tổng hợp
enzyme protease của nấm mốc Mucor elegans để xây dựng quy trình sản xuất giống
khởi động từ loại nấm mốc này phục vụ cho sản xuất chao. Kết quả cho thấy đã xác
định được loại nguyên liệu thích hợp là bột đậu tương, tỷ lệ phối trộn với gạo là
50/50.[10]
Wang và Hesseltine (1975) sản xuất lượng lớn bào tử Rhizopus oligosporus trên
cơ chất tấm gạo và lúa mì kết quả cho thấy đạt sản lượng 109 bào tử/gck dùng sản xuất
tempeh, và khi trữ ở 40C thì có thể bảo quản được trong 6 tháng [38].
Thanh và Nout (2004) đã xác định số lượng bào tử tổng số, số bào tử nấm mốc
Rhizopus oligosporus sống bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu.
Xác định số lượng bào tử sống, chết và miên trạng bằng phương pháp nhuộm huỳnh
quang mẫu trước và sau xử lý [36].
Thanh và Nout (2002) đã nghiên cứu bảo quản bào tử của Rhizopus oligosporus
khả năng sống của bào tử đã giảm đi nhiều sau 1 tháng bảo quản ở 250C cũng như 50C
và tiếp tục giảm ít đi sau đó [37].

Qua kết quả nghiên cứu, đề tài đã đạt được các kết quả như sau:
Kết quả phân lập và làm thuần chủng nấm trên các sản phẩm chao.
Kết quả thu nhận được bộ gen DNA.
Kết quả nhân bản được vùng gen ITS bằng phương pháp PCR.
Kết quả có hoạt tính protease, phân giải protein tạo vòng trong suốt.

3


Đồ Án Tốt Nghiệp

Kết quả lên mốc tốt.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Nội dung của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương:
Chương I: Tổng quan tài liệu giới thiệu chi tiết về cây và hạt đậu nành, thành
phần hóa học trong hạt đậu nành, giới thiệu về đậu nành, chao và các chủng nấm
mốc thường có trong chao, một số nghiên cứu các chủng nấm mốc ứng dụng sản
xuất các sản phẩm chao truyền thống.
Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (bao gồm các nguyên vật
liệu và phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài).
Chương III: Kết quả và biện luận đưa ra kết quả các thí nghiệm tiến hành
trong đề tài và phân tích các số liệu cụ thể.
Chương IV: Kết luận và kiến nghị đưa ra các kết luận thí nghiệm trong đề tài
đã đạt được và những vấn đề cần phải làm tiếp trong thời gian tới.

4


Đồ Án Tốt Nghiệp



Ở nước ta đậu nành được trồng tập trung ở các tỉnh miền núi và trung du: Sơn
La, Cao Bằng,..
1.1.2 Gía trị kinh tế của cây đậu nành
1.1.2.1 Gía trị về mặt thực phẩm
Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình
khoảng từ (35,5 - 40%). Trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ (6,2 - 12%), ngô
(9,8 - 13,2%), thịt bò (21%), thịt gà (20%), cá (17 - 20%) và trứng (13 - 14,8%), lipit từ
(15 - 20%), hydratcacbon từ (15-16%) và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng
cho sự sống [14]. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số các protein có
nguồn gốc thực vật. Hàm lượng protein trong hạt đậu tương cao hơn cả hàm lượng
prôtein có trong cá, thịt và cao gấp 2 lần so với các loại đậu đỗ khác.
Hàm lượng axit quan trọng có chứa lưu huỳnh như methionin và sixtin của đậu
tương cao gần bằng hàm lượng các chất này có trong trứng gà. Hàm lượng cazein, đặc
biệt lisin cao gần gấp rưỡi lần chất này có trong trứng. Vì thế mà khi nói về giá trị của
protein trong hạt đậu tương là nói đến hàm lượng protein cao và sự cân đối của các loại
axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có các thành
phần tạo colesteron. Ngày nay người ta mới biết thêm hạt đậu tương có chứa lexithin,
có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ, tái tạo các mô, làm cứng xương
và tăng sức đề kháng của cơ thể. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn
các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng. Lipit của
đậu tương chứa một tỉ lệ cao các axít béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồng hoá
cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm (52-65%), oleic từ (25-36%), linolenolic
khoảng (2-3%) [1]. Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ
động mạch. Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng
vitamin B1 và B2 ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C, .... Đặc biệt trong
hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lên nhiều, đặc biệt là vitamin C.
Phân tích thành phần sinh hoá cho thấy trong hạt đậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm
6


7


Đồ Án Tốt Nghiệp

bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng
sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N.
Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong
thân chiếm (0,05%), trong lá (0,19%) [3].
1.1.3 Thành phần hóa học trong hạt đậu nành [8].
Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng là loại
tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều.
Hạt đậu nành có 3 bộ phận.
Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt.
Phôi chiếm 2%.
Tử diệp chiếm 90%.
Hạt đậu nành có thành phần hóa học như sau:
Bảng 1.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành.
Thành phần

Tỷ lệ

Protein Dầu (%) Tro (%)

Hydratcacbon

(%)
Hạt đậu nành nguyên

100


2,4

41,1

11

4,4

43

Vỏ hạt
Phôi

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)
Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một tỷ lượng
rất lớn. Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngoài hai thành phần
methionin và tryptophan ra còn có các acid amin khác, có số lượng khá cao tương
đương lượng acid amin có trong thịt .

8


Đồ Án Tốt Nghiệp

Bảng 1.2 Thành phần acid amin trong protein của đậu nành.
Lzolozin

1,1 %


5,4 %

Histidin

2,6 %

(Nguồn:Nguyễn Đức Lượng)
Trong protein đậu nành glubolin chiếm (85 – 95)%. Ngoài ra còn có một lượng
nhỏ anbumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin.
Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành. Phần hydratcacbon có thể chia
làm 2 loại: loại tan trong nước và loại không tan trong nước. Loại tan trong nước chỉ
chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcacbon.
Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành.
Xenluloza

4%

Hemixenluloza

15,4 %

Stachyoza

3,8 %

Rafinoza

1,1 %

Saxaroza


37 mg/kg
90 – 150 mg/kg

Sắt
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)
Ngoài ra đậu nành còn chứa nhiều vitamin khác nhau.
Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành.

11,0 – 17,5 mg/lg

Thiamin

3,4 – 3,6

Riboflavin

21,4 – 23,0

Niaxin

7,1 – 12,0

Pyridoxin
Biotin

0,8
13,0 – 21,5

Acid tantothenic

1.2 Tổng quan về đậu phụ
Đậu phụ là một sản phẩm được sản xuất từ đậu nành. Đậu phụ không chỉ được
sản xuất ở Việt Nam mà còn được sản xuất nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, các nước
Đông Nam Á và cả các nước Châu Âu như Hà Lan, Pháp,…[8].
Đậu phụ là thực phẩm phổ biến ở các nước Đông Nam Á, có hàm lượng protein
rất cao [34]. Đậu phụ chứa khoảng (6,0 – 8,4) % protein và (79 – 87)% nước, pH trung
tính (5,2 – 6,2).
1.3 Tổng quan về chao [8]
Chao là sản phẩm lên men được sản xuất từ đậu nành. Vì qua quá trình lên men
chao có hệ số tiêu hóa cao hơn nhiều so với đậu phụ.
Chao có nhiều sản phẩm khác nhau như chao nước, chao bánh, chao đặc và chao
bột .
Bảng 1.6 Thành phần hóa học của chao
Thành phần

Các loại sản phẩm chao
Chao nước
Phần cái (%)

Chao bánh (%)

Phần nước (%)

Hàm ẩm

73 – 75

-

65 – 70


6,0 – 6,5

Chất béo

8,0 – 8,5

-

9,0 – 10

Độ chua

110,0 – 120

mg NaOH

0,1 N/100

Các acid amin không thay thế (g/kg)

Lizin

2,84 – 2,9

11

5,3 – 5,5



Metionin

0,4 – 0,5

0,4 – 0,5

0,4 – 0,45

Lzolozin

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)
Do quá trình lên men các enzyme của vi sinh vật tham gia thủy phân protein
thành các acid amin, lipit thành các este thơm nên chao có giá trị dinh dưỡng cao và có
mùi vị rất đặc trưng.
1.4 Nấm mốc thường gặp trong chao
Để sản xuất chao thường sử dụng giống khởi động từ giống nấm mốc: Mucor
spp, Rhizopus spp, Actinomucor spp.
Đây là các giống nấm có màu trắng đục, trắng ngà không làm ảnh hưởng tới
màu sắc của sản phẩm, hệ sợi nấm mảnh nhưng dài có khả năng tạo thành một lớp
màng mỏng xung quanh miếng chao, có tác dụng giữ hình dáng cho chao được ổn định
[9].
Tuy nhiên, hầu hết các chủng nấm Actinomucor spp chỉ thích hợp với nhiệt độ
môi trường tương đối thấp 18-200C đó chỉ sử dụng được các loài nấm mốc này ở
những khoảng thời gian nhất định trong năm.
Rhizopus spp rất nhanh hình thành bào tử, bào tử lại có màu đen đậm do đó ít
nhiều ảnh hưởng tới màu sắc sản phẩm, do đó có ngưỡng nhiệt độ thích hợp rất rộng
20-350C người ta chỉ sử dụng các loài nấm mốc Rhizopus spp vào mùa hè.
Giống nấm mốc Mucor spp thường được lựa chọn hơn cả vì nó khắc phục được
nhược điểm của cả hai giống trên. Các loài nấm mốc Mucor spp thường sử dụng trong


số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA
tổng số cho phù hợp.
Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên
thường được sử dụng:

13


Đồ Án Tốt Nghiệp

-

Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp
thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với
hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử
dụng nồng độ muối cao 11 (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự
hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K.

-

Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương
pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung
môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với
vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có
cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết.

-

Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối
hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến

khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích
khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự
base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm
một mồi xuôi và một mồi ngược .
1.5.2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS - rDNA
Gen rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có
nhiều bản sao và vùng không mã hóa cho bất kì protein nào. Đây là vùng gene bảo tồn
nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các sinh vật
cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến
hóa, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của vi sinh vật
cũng như các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao
đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thường không
chính xác và cần khoảng thời gian dài[16].
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch
đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương
pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên
cứu liên quan đến rDNA. Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ
sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di
truyền của nhiều loài nấm sợi. Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) – rDNA là vùng
có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa
15


Đồ Án Tốt Nghiệp

của vi sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định các
biệt hóa trong cùng loài để lập phổ hệ di truyền [18]. Cặp mồi được sử dụng trong đề
tài này là mồi xuôi ITS1-F (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A) [40] . Và mồi
ngược ITS4-R (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)[40].

tự trong ngân hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất
với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro
1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp

16