Header Page 1 of 128.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÕNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
*********

TẠ VIỆT HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, BẢO QUẢN, HOẠT HÓA
VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA TẾ BÀO GỐC
MÔ MỠ TỰ THÂN ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN
THOÁI HÓA KHỚP GỐI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2017

Footer Page 1 of 128.


Header Page 2 of 128.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÕNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
*********

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn và PGS.TS Nguyễn Thị Phi Nga, người
Thầy đã hướng dẫn trực tiếp, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong
suốt quá trình thực hiện luận án, đồng thời là người Thầy đã định hướng và
truyền cho tôi lòng say mê và những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu
khoa học.
- Các Thầy, các Cô trong Hội đồng chấm luận án đã dành nhiều thời
gian và công sức chỉ bảo giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thiện bản luận án
này.
- PGS.TS Trần Viết Tiến, Giám đốc Bệnh viện Quân y 103 - Chủ nhiệm
đề tài cấp Nhà nước cùng toàn thể các thành viên tham gia đề tài đã tận tình
giúp đỡ và hợp tác để tôi có thể hoàn thành luận án.
- Tập thể bác sĩ, điều dưỡng viên Khoa Khớp và Nội tiết, Bệnh viện
Quân y 103 đã động viên và hỗ trợ nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện
đề tài luận án.
- Tập thể cán bộ và nhân viên Bộ môn Khoa Huyết học – Truyền máu,
Bệnh viện Quân y 103 đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.

Footer Page 3 of 128.


Header Page 4 of 128.

Xin được chân thành cảm ơn các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp
đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với bố mẹ và anh chị em trong
gia đình, đặc biệt là vợ và hai con đã luôn là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn
thương yêu, khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tình cảm,
tinh thần và vật chất cho tôi để hoàn thành tốt chương trình học tập và thực


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

3

1.1. Những hiểu biết cơ bản về tế bào gôc

3

1.1.1. Khái niệm chung và phân loại

3

1.1.2. Cách gọi tên tế bào gốc

6

điều trị thoái hóa khớp gối

Footer Page 6 of 128.

26
34


Header Page 7 of 128.

1.4.1. Trên thế giới

35

1.4.2. Tại Việt nam

36

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

38

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

38

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

39


60

3.1.1. Đặc điểm dịch tễ

60

3.1.2. Đặc điểm lâm sàng

62

3.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng

63

3.2. Kết quả phân lập, bảo quản và hoạt hóa tế bào gốc mô mỡ

66

3.2.1. Kết quả chọc hút mô mỡ và phân lập SVF

66

3.2.2. Chất lượng tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản

67

3.2.3. Kết quả hoạt hóa TBG mô mỡ bằng HTGTC và ánh sáng đơn

72



91

4.1.1. Đặc điểm về dịch tễ học

91

4.1.2. Đặc điểm lâm sàng

94

4.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng

95

4.2. Hiệu quả của các quy trình phân lập, bảo quản và hoạt hóa tế

97

bào gốc mô mỡ
4.2.1. Quy trình chọc hút mô mỡ và phân lập SVF

97

4.2.2. Chất lượng tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản

98

4.2.3. Hoạt hóa TBG mô mỡ bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc



Header Page 9 of 128.

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACD

Acid citric Citrat natri Dextrose

ACR

American Collegue of Rheumatology (Hội thấp khớp
học Mỹ)

ADAMTS

A

Disintegrin

and

Metalloproteinase

with

Thrombospondin Motifs
ADSC

Adipose derived stem cells (tế bào gốc mô mỡ)

IL

Interleukin

MMP

Matrix Metalloproteinase

MSC

Mesenchymal stem cell (tế bào gốc trung mô)

mPGES-1

microsomal Prostaglandin E Synthase-1

Footer Page 9 of 128.


Header Page 10 of 128.

NSAIDs

Non-steroidal anti-inflammatory drugs (thuốc chống
viêm không steroid)

PRP

Platelet Rich Plasma (huyết tương giàu tiểu cầu)



WOMAC

The Western Ontario and McMaster Universities
Osteoarthritis Index (thang điểm đo mức độ cải thiện
chức năng vận động của khớp)

Footer Page 10 of 128.


Header Page 11 of 128.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1.

Các dấu ấn trên bề mặt của TBG mô mỡ

12

3.1.

Đặc điểm về tuổi, giới của các đối tượng nghiên cứu


63

điểm WOMAC giữa hai nhóm
3.7.

So sánh các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và tốc độ

64

máu lắng giữa hai nhóm
3.8.

So sánh các chỉ số sinh hóa giữa hai nhóm

64

3.9.

Giai đoạn tổn thương khớp trên hình ảnh Xquang của hai

64

nhóm
3.10.

Các chỉ tiêu đánh giá sụn khớp trên MRI của hai nhóm

65

3.11.

hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 42)
3.15.

Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ hoạt hóa và không

73

hoạt hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 6)
3.16.

Số lượng tế bào trung bình mỗi lần tiêm

74

3.17.

Điểm đau theo thang điểm VAS tại các thời điểm theo dõi

74

3.18.

Biến đổi mức độ đau theo thang điểm VAS theo thời gian

75

theo dõi của nhóm nghiên cứu (n = 84)
3.19.

Đặc điểm rối loạn chức năng vận động theo thang điểm


Giai đoạn tổn thương khớp trên Xquang theo thời gian theo

79

dõi
3.25.

Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu trong xương đùi

79

trên MRI theo thời gian theo dõi
3.26.

Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu ngoài xương đùi

80

trên MRI theo thời gian theo dõi
3.27.

Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại mâm chày trong trên MRI

81

theo thời gian theo dõi
3.28.

Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại mâm chày ngoài trên MRI

3.32.

Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại mâm chày ngoài trên

83

MRI theo thời gian theo dõi
3.33.

Mức độ tổn thương đại thể sụn khớp trước và sau điều trị

85

3.34.

Mức độ tổn thương vi thể sụn khớp trước và sau điều trị

85

3.35.

Sự phục hồi tổn thương sụn khớp BN BV103-37

86

3.36.

Biến đổi chỉ hồng cầu và tiểu cầu ở hai nhóm

88

67

3.3.

Biến đổi điểm đau theo thang điểm VAS theo thời gian

75

theo dõi
3.4.

Biến đổi mức độ đau theo thang điểm VAS của nhóm

76

nghiên cứu
3.5.

Footer Page 14 of 128.

Biến đổi chỉ số Circularity ở nhóm nghiên cứu

84


Header Page 15 of 128.

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình


PKCδ là nút tín hiệu của nhiều con đường gây THK

25

2.1.

Sơ đồ nghiên cứu

40

2.2.

Thước đánh giá thang điểm đau VAS: mặt bệnh nhân quan

43

sát
2.3.

Thước đánh giá thang điểm đau VAS: mặt số thầy thuốc

43

đánh giá
2.4.

Tiêm dung dịch Tumescent

47


2.10.

Thu thập hỗn dịch chứa SVF

49

2.11.

Ly tâm tách SVF

49

2.12.

Ly tâm, chuyển lớp huyết tương và buffy coat

50

2.13.

Hoạt hóa HTGTC bằng Calcium Activator Solution

50

Footer Page 15 of 128.


Header Page 16 of 128.

2.14.


3.2.

Nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ

69

3.3.

Hình ảnh TBG mô mỡ nhuộm Giemsa

70

3.4.

Kết quả phân tích biểu hiện một số dấu ấn bề mặt của TBG

71

mô mỡ sau khi cấy chuyển lần 3 (P3)
3.5.

Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ

72

3.6.

Khả năng tạo CFU-F của 6 mẫu TBG mô mỡ hoạt hóa và


Trái ngược với sự tiến triển tăng dần của bệnh lý thoái hóa khớp gối,
cho đến nay vẫn còn rất ít biện pháp điều trị hữu hiệu có tác dụng ngăn chặn
căn bệnh này. Phần lớn các biện pháp như dùng thuốc giảm đau, chống viêm
và bổ xung dịch khớp chỉ có tác dụng điều trị triệu trứng cho người bệnh mà
không giải quyết được quá trình tiến triển của bệnh thoái hóa khớp. Can thiệp
ngoại khoa như nội soi cắt bỏ gai mâm chày, phục hồi các dây chằng, cấy sụn,
thay khớp… có thể đưa tới các biến chứng sau phẫu thuật như tắc mạch,
nhiễm khuẩn hay xa hơn là lỏng khớp. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra
một phương pháp mới, thực sự tác động tới quá trình phục hồi sụn là một việc
làm cấp thiết nhằm đem lại kết quả cao trong điều trị bệnh.
Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy công nghệ tạo các mô với việc
sử dụng tế bào gốc phôi hoặc tế bào gốc trưởng thành có tiềm năng điều trị to
lớn, đặc biệt các tế bào gốc trưởng thành tự thân phù hợp về miễn dịch không
gây những vấn đề đạo đức như sử dụng tế bào gốc phôi và đã được chứng
minh là an toàn [32]. Hiện nay tế bào gốc trưởng thành có thể được lấy từ
nhiều nguồn khác nhau, trong đó mô mỡ được coi là một nguồn rất tiềm năng
và dễ thực hiện để phân lập tế bào gốc dùng trong điều trị. Các nghiên cứu

Footer Page 17 of 128.


Header Page 18 of 128.

đầu tiên được triển khai tại Hàn Quốc và Úc tiêm trực tiếp tế bào gốc tự thân
từ mô mỡ vào khớp để điều trị thoái hóa khớp gối và khớp háng cho thấy biện
pháp điều trị này an toàn và bước đầu có hiệu quả tốt cho người bệnh [88],
[120]. Huyết tương giàu tiểu cầu cũng đã được sử dụng tương đối rộng rãi
trong điều trị thoái hóa khớp nhờ tác dụng của các yếu tố tăng trưởng có
nguồn gốc từ tiểu cầu. Bên cạnh đó hoạt hóa quang bằng ánh sáng đơn sắc
năng lượng thấp cũng có tác dụng kích thích các quá trình tăng sinh và biệt

tự tái tạo, sinh ra những tế bào giống hệt chúng và biệt hoá thành những loại
tế bào chuyên biệt trong những điều kiện nhất định.
Tế bào gốc (TBG) thể hiện khả năng tự thay mới (self renewal) và biệt
hóa (differentiation) bằng cách phát triển tạo ra hai loại tế bào con khác nhau.
Loại tế bào con thứ nhất sẽ sinh sản bằng cách phân bào nhiều lần để tạo ra
các tế bào tiền thân (progenitors) và tiếp tục biệt hóa để trở thành các tế bào
trưởng thành. Loại tế bào con thứ hai vẫn ở trạng thái không hoạt động ban
đầu, chúng giữ nguyên kiểu hình TBG và tất cả những khả năng của tế bào
mẹ ban đầu cho tới khi có những tín hiệu hoặc hiện tượng kích hoạt mới xảy
ra để đáp ứng tăng sinh biệt hóa. Hiện tượng này có vai trò rất quan trọng vì
nếu tất cả tế bào con đều trở thành tế bào tiền thân thì nguồn TBG sẽ dần dần
bị cạn kiệt sau mỗi lần hoạt hóa và nhanh chóng làm suy giảm số lượng TBG
cần thiết để hỗ trợ quá trình đổi mới, hồi phục và sửa chữa mô trong suốt cuộc
đời [6], [9].
Tế bào gốc có thể có nguồn gốc từ phôi, bào thai hoặc từ những cá thể
trưởng thành có các đặc tính chung nhưng khác nhau về khả năng tăng sinh và
biệt hóa.
Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell)
Năm 1998, James Thomson lần đầu tiên phân lập được một loại TBG
phôi tại khối tế bào bên trong của phôi nang (blastocyt) có được nhờ thụ tinh
nhân tạo vì mục đích nghiên cứu. Cùng thời gian đó, Jonhn Gearhart cũng

Footer Page 19 of 128.


Header Page 20 of 128.

tách được một loại TBG khác gọi là tế bào mầm phôi (embryonic germ cell)
từ phôi 6 tuần tuổi. Hai loại tế bào này đều có những đặc tính cơ bản chung
của TBG nhưng lại khác nhau về tiềm năng tăng sinh tự tái tạo mà không biệt

một chức năng khác, được gọi là biệt hóa ngược (dedifferentiation) [2], [13].
Những phát hiện này có thể đem lại tiềm năng lớn trong việc điều trị các mô
bị bệnh hoặc tổn thương bằng sử dụng TBG tự thân từ một mô lành của cơ thể
và làm thay đổi những phương pháp điều trị ghép tổ chức và tái tạo tổ chức.
TBG trưởng thành có mặt trong nhiều tổ chức của cơ thể, tuy nhiên với
một số lượng rất ít. Ngược lại những TBG của thai phân bố không giống như
vậy, chúng chỉ có ở một số vị trí, trong một số tổ chức nhất định của thai [2].
TBG thai có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy sau khi chúng được tách
ra từ phôi hoặc thai. Tùy theo điều kiện của môi trường nuôi cấy mà những
TBG thai có thể tạo nên những cụm tế bào có thể biệt hoá tự nhiên tạo ra
nhiều loại tế bào. Nếu như những TBG thai trong nuôi cấy chưa biệt hoá được
tiêm vào cơ thể chuột đã bị làm tổn thương hệ thống miễn dịch sẽ tạo nên
khối u lành tính chứa hỗn hợp những tế bào đã biệt hoá một phần ở những con
chuột này [2], [85]. Hiện tượng đó không thấy đối với TBG của cá thể trưởng
thành. Những TBG ở cá thể trưởng thành có trong các tổ chức bình thường
như não, tuỷ xương, ruột... thường chỉ có thể sản xuất ra những tế bào đặc
hiệu cho loại tổ chức cội nguồn của chúng. Những TBG của một cá thể
trưởng thành khi tách khỏi vi môi trường bình thường của cơ thể, đưa vào môi
trường nuôi cấy thì khả năng biệt hoá bị hạn chế hơn rất nhiều so với những
TBG của thai. Chưa thấy một loại TBG nào của cá thể trưởng thành lại có khả
năng biệt hoá thành những tế bào có nguồn gốc từ cả ba lá mầm phôi. Điều đó
chứng tỏ TBG của cá thể trưởng thành không có cùng mức độ đa tiềm năng so
với những TBG phôi và thai.
Những TBG có nguồn gốc khác nhau cũng không giống nhau về khả
năng phát triển trong môi trường nuôi cấy. TBG thai người có thể tạo ra trong
phòng thí nghiệm với một số lượng rất phong phú và có thể tăng sinh nhưng
vẫn giữ nguyên trạng thái chưa biệt hoá qua nhiều thế hệ. Trên thực tế nghiên
cứu và ứng dụng lâm sàng, khả năng tạo ra một số lượng lớn tế bào từ một

Footer Page 21 of 128.


Footer Page 22 of 128.


Header Page 23 of 128.

- Tế bào gốc đa tiềm năng (multipotent): là các tế bào có khả năng biệt
hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, được phân lập từ mô đã biệt hóa nguồn
gốc thai hoặc cơ thể trưởng thành. Các tế bào được tạo thành nằm trong một
hệ tế bào có liên quan mật thiết, ví dụ chỉ tạo nên các tế bào máu (bao gồm
hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), hoặc chỉ tạo nên các tế bào của hệ thống thần
kinh. Thường thì các TBG trưởng thành như TBG tạo máu, TBG thần kinh
chỉ có tính đa tiềm năng; nhưng trong những điều kiện nhất định, chúng vẫn
có thể chuyển biệt hóa và trở nên có tính vạn tiềm năng.
- Tế bào gốc vài tiềm năng (oligopotent), bốn tiềm năng (quadripotent),
ba tiềm năng (tripotent), hai tiềm năng (bipotent), đơn tiềm năng (unipotent)
là các TBG định cư hoặc các tế bào tiền thân tồn tại trong các mô thai hoặc cơ
thể trưởng thành. Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa hạn chế, chỉ tạo ra một
hoặc vài dòng tế bào nhất định. Ví dụ: tế bào tiền thân dòng tủy, tế bào tiền
thân trung mô, tế bào tiền thân thần kinh đệm…
1.1.2.2. Theo vị trí phân lập tế bào
- Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell - ESC): là TBG được phân lập
ở ngày thứ 6 của giai đoạn phôi nang (blastocyt), tại khối tế bào bên trong
(ICM). Đây là loại TBG vạn tiềm năng có khả năng biệt hóa tạo ra tẩt cả các
tế bào có nguồn gốc phát triển từ ba lá phôi [13].
- Tế bào mầm phôi (embryonic germ cell - EGC): là các TBG được thu
nhận từ mào sinh dục (genital ridge) của phôi tuần thứ 6, là TBG vạn tiềm
năng và được coi là nguồn gốc biệt hóa thành các tế bào sinh dục. Khả năng
tăng sinh của tế bào mầm phôi ít hơn so với tế bào gốc phôi, trong 2 năm nó
phân chia khoảng 40-80 lần so với 300-450 lần của TBG phôi [6].

tác dụng cách nhiệt. Còn đối với các cơ quan nội tạng, mô mỡ bao quanh như
vật đệm có vai trò bảo vệ. Ở động vật có hai loại mô mỡ: mô mỡ nâu (brown
adipose tissues - BAT) và mô mỡ trắng (white adipose tissues - WAT). Tùy
theo loài mà có số lượng và sự phân bố khác nhau. Mô mỡ nâu gặp chủ yếu ở
trẻ sơ sinh hoặc động vật có vú ngủ đông. Về hình thái nó có màu đậm do mật
độ ty thể cao trong bào tương, vai trò chính là sinh nhiệt cho cơ thể. Mô mỡ

Footer Page 24 of 128.


Header Page 25 of 128.

trắng gặp ở động vật có vú. Ở người, mô mỡ trắng chiếm khoảng 20% trọng
lượng cơ thể (ở nam) và 25% (ở nữ) [13]. Tế bào mỡ trưởng thành của mô mỡ
trắng là giọt lipít lớn và rất ít nguyên sinh chất, nhân nằm ở rìa tế bào, chứa
một không bào lớn, ít ty thể. Tùy thuộc vào vị trí cư trú mà mô mỡ trắng có
chức năng chuyên biệt. Mô mỡ trắng ở các cơ quan bụng và ngực (không bao
gồm tim), gọi là mỡ nội tạng, có chức năng tiết cytokin viêm và do đó liên
quan đến các quá trình viêm tại chỗ và toàn thân. Mô mỡ trắng ở cơ xương
tiết ra acid béo tự do, interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử u-α (tumor
necrosis factor α - TNFα), đóng vai trò quan trọng trong sự đề kháng insulin.
Mô mỡ trắng ở mô tim tiết nhiều cytokin trong các phản ứng viêm tại chỗ và
hóa hướng viêm, ảnh hưởng tới sự phát triển xơ vữa động mạch và tăng huyết
áp tâm thu của cơ thể. Mô mỡ trắng ở thận đóng vai trò trong việc tái hấp thu
natri và do đó có thể ảnh hưởng đến thể tích máu nội mạch và gây bệnh cao
huyết áp.
Mô mỡ trắng có nhiều chức năng bao gồm cách nhiệt, đệm cơ học, dự
trữ năng lượng carbon dư thừa dưới dạng triacylglycerol và là trung gian cân
bằng glucose nội môi. Mô mỡ trắng cũng đóng vai trò quan trọng như một cơ
quan nội tiết/miễn dịch bằng cách tiết adipokin như các cytokin viêm, yếu tố