BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP TÌM DEMODEX, BÊNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG - Pdf 56

1

BỘ Y TẾ
BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP
TÌM DEMODEX

Người thực hiện:
Chủ nhiệm:

TS.Bs. Trần Cẩm Vân

Thư ký:

Hà Nội, tháng 7 năm 2019

2

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BN

: Bệnh nhân

KHV

: Kính hiển vi

tiếp dưới kính hiển vi (direct microscopic examination DME); tìm Demodex spp
ở vẩy da; sinh thiết toàn bộ lớp da; xác định Demodex spp bằng DNA; xác
định Demodex spp bằng máy soi da. Sinh thiết bề mặt da tiêu chuẩn (SSSB)
và soi trực tiếp bằng kính hiển vi (DME) thường được sử dụng để xác
định mật độ ký sinh trùng Demodex (Dd). Phương pháp SSSB bao gồm nhỏ
một giọt chất kết dính cyanoacrylic trên lam kính, áp bề mặt lam kính mang
chất dính lên da, đợi khô và lấy ra sau khoảng 1 phút. Trước đó, diện tích bề
mặt tiêu chuẩn 1cm 2 được vẽ trên lam kính. SSSB là một phương pháp lấy

6
mẫu không xâm lấn, qua đó có thể thu thập một phần bề mặt của lớp sừng và
nang lông. Với SSSB, lấy được phần nông lớp sừng của nang lông và
Demodex sống ở đó. Ngược lại, soi trực tiếp, không thấy được các nang lông
(đặc điểm quan trọng để phát hiện Demodex).
Tuy nhiên, trước đây chưa có nghiên cứu nào so sánh hai phương pháp
này với mối liên quan tới lâm sàng và số lượng ký sinh trùng. Để phục vụ tốt
hơn cho công tác chẩn đoán và điều trị bệnh nhân, chúng tôi tiến hành:
“Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật soi trực tiếp Demodex tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương”.

7
Mục tiêu:
1. Cải tiến kỹ thuật soi trực tiếp tìm Demodex bằng kỹ thuật sinh thiết
bề mặt da tiêu chuẩn (SSSB)
2. So sánh kết quả soi trực tiếp tìm Demodex của kỹ thuật sinh thiết bề
mặt da tiêu chuẩn (SSSB) và KOH tiêu chuẩn

D.folliculorum trưởng thành có chiều dài 0,3- 0,4 mm và D.brevis có
chiều dài ngắn hơn là 0,15-0,2 mm [9]. Hai loài có cấu trúc giống nhau, chỉ
khác nhau độ dài của đuôi con cái hơi ngắn hơn và tròn hơn con đực. Không
thể trông thấy chúng bằng mắt thường, nhưng dưới kính kiển vi thì cấu trúc
của chúng được thấy rõ. Nó có hình thái bán trong suốt, kéo dài cơ thể bao
gồm hai đoạn đầu bụng gắn dính khớp nhau. Có 4 đôi chân phân đoạn, ngắn
dính liền với phần đầu của cơ thể. Cơ thể được bao phủ bởi các vẩy để cho
chúng gắn dính vào nang lông và phần miệng giống kim băng để ăn các tế bào
da, và các chất dầu nhờn tích tụ trong các nang lông. Các sinh vật này di
chuyển trên mặt với tốc độ chậm 8-16 mm/giờ chủ yếu vào ban đêm, khi có
ánh sáng chúng di chuyển lùi lại nang lông.
2.2. Sinh thái
D.folliculorum sống thành cụm, còn D.brevis sống đơn độc. Vòng đời
của Demodex thường 2-3 tuần. Một con Demodex cái đẻ từ 15-20 trứng trong
nang lông gần tuyến bã. Trứng phát triễn qua 5 giai đoạn: Trứng, ấu trùng,
tiền nhộng, nhộng và con trưởng thành giai đoạn trứng 12 giờ, giai đoạn ấu
trùng 60 giờ, tiền nhộng 36 giờ, nhộng 72 giờ và trưởng thành 60 giờ. Mất
khoảng 3-4 ngày từ giai đoạn trứng đến tiền nhộng. Khoảng 7 ngày từ nhộng
phát triễn thành con trưởng thành. Con trưởng thành sống 5-6 ngày trong
nang lông. Demodex thích sống trong môi trường nóng ẩm và hoạt động mạnh
trong bóng tối.
Demodex đực trưởng thành sẽ rời khỏi nang lông đi tìm con cái, trong
khi con cái trưởng thành vẫn còn ở trong nang lông, Demodex bò lên từ miệng
nang lông sang nang lông khác, ở nang lông mới sự thụ tinh bắt đầu.Sự thụ
tinh xảy ra ở miệng nang lông. Sau khi thụ tinh, con cái đào hang đến tuyến
bã và đẻ trứng ở đó [1]

10
3. Triệu chứng lâm sàng

- Đỏ da dai dẳng, nhạy cảm với ánh nắng
- Vẩy da ở nang lông
- Tổn thương là những sẩn mụn nước ( papulovesicle), mụn nước mụn mủ
( vesicopustules ), đặc biệt không có nhân (noncomedon)
- Tổn thương không đối xứng, không có biểu hiện giãn mạch, thường có phối
hợp viêm bờ mi ( demodectic blepharitis )
- Tiền sử thường dùng thuốc bôi chứa steroid
- Thường gặp trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch
Mô bệnh học: Thấy bạch cầu đơn nhân thâm nhập viêm xung quanh
nang lông, đôi khi hình thành u hạt.
2.3. Viêm da do Demodex dạng trứng cá đỏ thể u hạt. (Granulomatous
rosacea ) hay còn gọi (demodicidosis gravis )
Bệnh biểu hiện sẩn đỏ, mụn mủ, abces ăn sâu và ở một bên mặt, tồn tại
dai dẳng, không đáp ứng với điều trị thông thường
Thể này thường phối với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (có hay
không có HIV).
Mô bệnh học: Thấy tổ chức u hạt bao gồm tế bào khổng lồ chứa dấu vết
của hiện tượng thực bào Demodex spp, có hoại tử ở trung tâm.
Ngoài ra VDDD có thể kèm theo rụng tóc và viêm bờ mi
- Viêm bờ mi ( blepharitis): Bệnh nhân có thể ngứa, nóng bỏng, đỏ bờ mi,
lông mi rụng, dày mi mắt, nhiều vẩy. Thường viêm bờ mi do Demodex kết
hợp với bệnh da ở xung quanh mi mắt.
- Rụng tóc: Thấy rụng tóc từng mảng, trên vùng rụng tóc thấy có sẩn đỏ, mụn
mủ.

12
3. Cận lâm sàng
Để xác định có nhiễm Demodex spp hay chẩn đoán VDDD có thể dùng
một trong các phương pháp sau:

+ Phải có loại cồn dính đặc biệt để dính 1 phần thượng bì và nang lông
mà không gây thương tổn da [11].
3.2. Kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi
- Lấy chất tiết từ tuyến bã bằng cách bóp chặt da vùng tổn thương muốn
lấy bệnh phẩm bằng ngón cái và ngón trỏ, các bệnh phẩm lấy được chuyển
qua lam kính, trộn với 1 giọt glycerin và phủ 1 lá men, kiểm tra dưới kính
hiển vi với độ phóng đại 40.
- Đánh giá kết quả
Nếu ≥ 5 con/cm2: Demodex spp là căn nguyên gây bệnh
Nếu < 5 con/cm2 : Demodex spp không phải căn nguyên gây bệnh [11].

Hình 1.2. Soi trực tiếp dưới kính hiển vi chất từ tuyến bã của bệnh
nhân

14
(a,b) phương pháp lấy mẫu: 1 cm2 da bị tổn thương bóp chặt giữa ngón
cái và ngón trỏ và sau đó dùng đầu cùn lấy chất tiết. (c) D.Folliculorum dưới
kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần (không ở trong nang lông)
Phương pháp SSSB mô tả đầu tiên bởi Marks và Dawber vào năm
1971[12], SSSB là một phương pháp không xâm lấn đơn giản được sử dụng
để nghiên cứu lớp sừng, các loại bệnh lý trong lớp này là mảng lớn của vi
sinh vật ở lớp sừng. Hai mươi hai năm sau vào năm 1993, SSSB 1 cm 2 để đo
Demodex spp (Forton và Seys đổi tên nó thành SSSB) được công bố trên hai
tạp chí. Nghiên cứu Demodex spp với SSSB ở bệnh nhân bệnh trứng cá đỏ và
người khỏe mạnh, các tác giả đề xuất 5 Demodex/cm2 như là ngưỡng tối ưu:
để đánh giá kết quả chẩn đoán với độ đặc hiệu cao (98%), kết quả dương tính
giả (2%), nhưng độ nhạy tương đối thấp (55%). Năm 2005 tiêu chuẩn được
mở rộng ra được sử dụng để chẩn đoán bệnh nhân biểu hiện lâm sàng của
VDDD bằng bởi SSSB. Năm 2003, Akilov và cộng sự cũng đã sử dụng

16
sinh thiết rồi kiểm tra bằng kính hiển vi.
3.4. Sinh thiết toàn bộ lớp da.
Sinh thiết toàn bộ nang, nhuộm Hematoxilin-Eosine, Soi tìm Demodex
spp dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần, tìm thấy Demodex spp ở nang
lông, xâm nhập viêm Lympho bào xung quanh mạch máu và trung bì nông
[4]. Phương pháp này ít được sử dụng.
3.5. Xác định Demodex spp bằng DNA.
Dùng kỹ thuật real-Time PCR để phát DNA Demodex spp, sau đó
khuếch đại, giải mã xác định loài Demodex [14].
3.6. Xác định Demodex spp bằng máy soi da.
Xác định Demodex spp bằng máy soi da là phương pháp chẩn đoán hình ảnh
ở thượng bì và trung bì nông không xâm lấn, nó phát hiện hiệu quả Demodex
spp và đo được mật độ của nó [15]

17

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
- Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng bệnh viêm da do demodex: trứng
cả đỏ, viêm nang lông.
- Bệnh nhân không giới hạn độ tuổi
- Không dùng thuốc diệt ký sinh trùng, bong sừng bạt vảy trước đó 1
tháng
- Đồng ý tham gia nghiên cứu

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 1
2.4.1.1. Thiết kế nghiên cứu
Mô tả cắt ngang
2.4.1.2. Cỡ mẫu
Công thức tính cỡ mẫu cho một ty lệ:

n= Z21-α/2 x

p (1 − p )
( pε ) 2

Z1-α/2: Hệ số tin cậy 95% (= 1,96)
Zβ: Lực mẫu 80% (= 0,842)
n: cỡ mẫu của nhóm người khỏe mạnh
p: ty lệ nhiễm Demodex trên bệnh nhân viêm da có demodex, p= 0,85
ε: giá trị tương đối (= 0,14)
Thay vào công thức có: n = 70
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 2
2.4.2.1.Thiết kế nghiên cứu
So sánh giá trị chẩn đoán của 2 phương pháp xét nghiệm
2.4.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu

19
* Cỡ mẫu tính theo công thức thử nghiệm lâm sàng của Tổ chức Y tế
Thế giới:

{Z

nhóm 2 gồm 60 bệnh nhân được lấy bệnh phẩm sử dụng kỹ thuật KOH tiêu
chuẩn.
2.4.3. Các kỹ thuật nghiên cứu

20
 Kỹ thuật sinh thiết bề mặt da tiêu chuẩn
+ Kỹ thuật lấy bệnh phẩm:
- Vị trí vùng mặt: giữa 2 cung mày, mi mắt, mũi, rãnh mũi má, má, cằm và
xung quanh miệng. Ngoài ra còn có lưng, ngực, da đầu,....
- Lấy một giọt keo cyanoacrylate nhỏ lên lam kính, áp nhẹ lên bề mặt da
cần sinh thiết ( chú ý tránh không để keo dính vào mắt ).
- Sau 30 giây đến 1 phút ( để keo khô ) kéo nhẹ lam kính ra. Trên bề mặt
lam kính mang theo một lớp da sinh thiết.
- Nhỏ lên 1 giọt hồn hợp (KOH 20%: Xanh Methylen = 1:2), đậy lam kính
- Quan sát dưới kính hiển vi
* Lưu ý:
- Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi đánh giá không quá 4 giờ
- Đối với BN bị viêm da dầu, hoặc BN dùng thuốc, mỹ phẩm, vẩy da dầu
nhiều, cần lau bớt lớp vẩy bên ngoài rồi mới tiến hành cạo để lấy bệnh
phẩm.
+ Làm tiêu bản:
- Nhỏ 1 – 2 giọt KOH 20% : Xanh Methylen lên lam kính có bệnh
phẩm sinh thiết
- Đậy lamen, có thể soi luôn
+ Nhận định kết quả:
Dùng vật kính 10X để xác định:
- Demodex gây bệnh ở người có 2 loài: D.folliculorum và D.brevis khác
nhau ở chiều dài cơ thể.
- Demodex trưởng thành, cơ thể chia làm 3 phần rõ rệt: Đầu (có 1 đôi râu,

- Ảnh hưởng của phương pháp SSSB và KOH tiêu chuẩn khi nhận định
kết quả trên kính hiển vi
- Kết quả số lượng ký sinh trùng Demodex của phương pháp SSSB và
KOH tiêu chuẩn.
2.6. Các biện pháp hạn chế sai số

22
Để loại trừ các sai số có thể xảy ra, trong nghiên cứu này đã thực hiện
các biện pháp sau:
- Thiết kế nghiên cứu chặt chẽ, các công cụ thu thập số liệu là các biểu
mẫu được chuẩn bị đầy đủ, chi tiết. Các kỹ thuật xét nghiệm đều được
thực hiện theo thường quy tại các phòng xét nghiệm chuẩn thức quốc
gia của bệnh viện Da liễu Trung Ương.
- Các thuật toán thống kê thường dùng trong y học cũng đã được sử dụng
tối đa để loại trừ các sai số ngẫu nhiên.
2.7. Phương pháp xử lý số liệu
- Dữ liệu về mẫu nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm SPSS 23.0
- Thống kê mô tả: được tính theo tần số tỉ lệ %, và được trình bày dưới
dạng bảng biểu.
- Thống kê phân tích:
- Dùng phép kiểm định khi bình phương và RR ở mức ý nghĩa 5%,
khoảng tin cậy (KTC) 95% để đo lường sự khác biệt trong các mối liên
hệ của kết quả nghiên cứu.
- Sử dụng test Fisher với các giá trị nhỏ hơn 5
- Dùng phép kiểm One-way-ANOVA để so sánh trung bình
2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu không vi phạm y đức vì tất cả người bệnh đều được hỏi ý
kiến và đồng ý tham gia nghiên cứu, các thủ thuật khám, lấy bệnh phẩm đều
không xâm hại đến người bệnh. Đây cũng là các xét nghiệm thường quy áp

Tổng số
Tuổi trung bình

KOH tiêu chuẩn

n

%

n

%

60

100

60

100

X ± SD
(min-max)
P
Bảng 3.2. Phân bố bệnh theo giới
SSSB

Phương pháp
Giới
Nam

n

KOH tiêu chuẩn
%

n

%

25
Tổng số
P

60

100

60

100

3.2. Kết quả xét nghiệm của phương pháp SSSB và KOH tiêu
chuẩn
Bảng 3.4. Thời gian trả kết quả xét nghiệm của phương pháp SSSB và
KOH tiêu chuẩn
SSSB

Phương pháp
Kết quả

Nhờ tải bản gốc

Tài liệu, ebook tham khảo khác

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP TÌM DEMODEX, BÊNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG - Pdf 56

Tài liệu, ebook tham khảo khác

Học thêm