MỞ ĐẦU
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Bò sát là động vật có nhiều đặc điểm sống khá phong phú và hấp dẫn
đồng thời có nhiều lợi ích. Từ nhiều thế kỷ trước, khoa học đã dành khá nhiều
thời gian và công sức để tìm hiểu về nhóm động vật có số lượng không nhiều
này, nhưng vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tìm hiểu của con người.
Ở Việt Nam, các loài bò sát đã được chú ý dùng làm thuốc chữa bệnh
từ thế kỉ XIV, nhưng mãi đến thời kỳ thực dân Pháp xâm lược nước ta mới có
những công trình nghiên cứu thực sự về Bò sát của các tác giả người nước
ngoài, đặc biệt là R.Bourret và cộng sự trong thời gian từ năm 1924 – 1944.
Tuy nhiên từ sau năm 1945 đến nay các công trình nghiên cứu về Bò sát đã
được đẩy mạnh nhiều hơn.
Trong số loài thằn lằn được biết ở Việt Nam, Leiolepis belliana (Gray,
1827) là một loài thuộc họ Nhông (Agamidae). Tên phổ thông ở Việt Nam là
nhông cát. Nhông cát thường gặp ở các dãi cát ven biển Việt Nam.
Từ rất lâu nhân dân ta đã biết sử dụng nhông cát để chữa các bệnh như
hen suyễn, ghẻ lở, còi xương ở trẻ con... Ngoài ra nhông cát còn được sử dụng
để ngâm rượu làm thuốc bổ như tắc kè và rắn. Do thịt nhông thơm và ngon
nên được sử dụng để làm thực phẩm. Mặt khác khi phân tích thành phần thức
ăn tự nhiên của chúng thấy có nhiều loài động vật và thực vật khác nhau,
trong đó có nhiều loài côn trùng có hại như cào cào, châu chấu, bọ xít, bướm,
ruồi. Do đó có thể nói nhông cát được xem là loài động vật phổ biến ở các
vùng cát ven biển miền Trung Việt Nam đã cùng với các loài động vật khác
trong hệ sinh thái giữ vai trò nhất định, không những đảm bảo nâng dần năng
suất sinh học trong thiên nhiên mà còn có vai trò ổn định thế cân bằng trong
các hệ sinh thái.
1
Như vậy, nhông cát là một trong những nguồn tài nguyên thiên nhiên
có giá trị. Nghiên cứu khai thác, sử dụng và bảo vệ nguồn tài nguyên động vật
và thực vật trong đó có nhông cát là rất cần thiết để góp phần vào sự nghiệp
phát triển kinh tế, văn hóa, khoa học và đời sống.

môi trên, vẩy môi dưới, lỗ đùi, một số tính trạng kích thước so với chiều dài
thân và chiều dài đầu.
- Tách chiết và tinh sạch ADN, sau đó xác định nồng độ và chất lượng
ADN của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier
3
Phần 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
I. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU NHÔNG CÁT
1. Trên thế giới
Theo E.H. Taylor thì Leiolepis belliana (Gray) được Gray xác định và
mô tả lần đầu vào năm 1827 dưới tên là Uromastyx belliana Gray dựa trên
hình vẽ của Hardwicke từ mẫu thu ở Penang (Malaysia). Năm 1864, trong
“Reptiles of British India”, Gunther gọi là Leiolepis guttata. Tên Leiolepis
belliana lại được Gray đặt vào năm1845 trong “Catalogue of the Lizards in
the British Museum”. Về sau, nhiều tác giả khác cũng đã sử dụng tên này như:
Ridley (1869), Boulenger (1890), Annandale (1900), Laidlaw (1901), Schmidt
(1927), Smith (1935), Taylor và Elbel (1950), Nertens (1961),...Tên loài này
cũng được một công trình khác của C.H. Pope nhắc đến. Gần đây, trong công
trình nghiên cứu về nhiễm sắc thể, A. KynpurHoBa cũng gọi là L.belliana.
Đặc biệt trong cuốn “Từ điển tên gọi các loài động vật năm thứ tiếng” (Tiếng
Nga) xuất bản năm 1989 đã nêu tên 5 loài thằn lằn thuộc giống Leiolepis
trong đó có loài Leiolepis belliana (Gray).
Cho đến nay, việc nghiên cứu các mặt của các phân loài và loài
trong giống Leiolepis trên thế giới tương đối còn ít. Trong số đó, đáng chú ý
là các công trình sau:
M. Smith (1935) đã mô tả loài Leiolepis belliana ở Ấn Độ, Miến
Điện và Srilanca. Cũng vào năm 1935, trong công trình nghiên cứu Bò sát ở
trung Quốc, C.H. Pope trình bày khoá để xác định các giống trong họ
Agamidae ở Trung Quốc và các loài trong giống Leiolepis. Theo C.H. Pope
thì ở Trung Quốc họ Agamidae có các giống sau: Draco, Phoxophrys,

2,74 m (8 – 9 feet) và sâu 1,22 – 1,52 m (4 – 5 feet). Những lúc trời rét và ban
đêm chúng chui vào hang và lấp kín cửa hang.
5
Đặc điểm cấu tạo giải phẩu đã được A.G.Edmund, R.Hoffstetter và
J.P.Gase trình bày trong “Biology of the Reptilia”. Khi nghiên cứu về răng
của các loài trong họ Agamidae, A.G.Edmund cho rằng L. belliana có 3 – 4
răng trước hàm, 12 răng hàm và 12 răng ở phần trước xương răng. Các răng ở
phần trước xương răng thường lớn và theo kiểu răng nanh. Đặc điểm của cột
sống và xương sườn của Leiolepis cũng giống như các loài trong họ Teiidae
và Agamidae nhưng có phần thân đốt và phần gian thân đốt không phân biệt
rõ.
Đặc điểm của các loài trong họ Agamidae cũng như Iguanidae có cấu
tạo giống Sphenodon. Còn cấu tạo của xương khẩu cái, xương hàm, xương lá
mía và ống đổ của cơ quan Jacobson theo kiểu “lỗ khoan cổ” như nhiều loài
thằn lằn khác.
Về cấu trúc nhân có công trình nghiên cứu của A.KynpurHoBa, khi
nghiên cứu kiểu nhân của ba loài thằn lằn họ Agamidae là Stellio chernovi,
Stellio himalayanus và Leiolepis belliana belliana. Kết quả nghiên cứu này
cho thấy các loài trên có bộ nhiễm sắc thể 2n = 36.
Về số lượng loài của giống Leiolepis Cuvier, theo công trình của nhiều
tác giả mà B.E.CokovoB làm chủ biên cho thấy có năm loài là L.belliana
(Gray), L. guttata Cuvier, L. peugensis Peters, L.reevessi (Gray) và
L.triploida Peters, tất cả đều sống ở châu Á.
Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả
loài nhông Leiolepis guentherpetersi (Theo Cuvier, 1829) là Leiolepis
belliana guttata Cuvier). Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh
vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên.
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức phân tử đối với loài này [4].
2. Ở Việt Nam
Tài liệu đầu tiên nói đến nhông cát L.belliana (Gray) của R. Bourret.

to; các vảy trên ổ mắt là các vảy chấm rất nhỏ. Màng nhĩ rộng và nông, đường
kính của nó gần bằng chiều dài lỗ mắt. Hai bên cổ có những nếp da nằm
ngang kéo ngang qua phần gáy.
7
Vẩy lưng nhỏ, hoá sừng; vẩy mặt bụng lớn hơn ở mặt lưng”.
Đặc điểm hình thái của con cái tương tự như con đực, chỉ khác ở một
số điểm sau: Con cái da ở hai bên sườn không thể bạnh ra khi ở tư thế dọa nạt;
ở con đực mặt lưng từ đầu đến đuôi màu phân ngựa với những vùng sẫm ở hai
bên, riêng mặt lưng phần thân có những chấm màu vàng viền đen hình mạng
lưới, mặt bụng từ đầu đến đuôi màu trắng đục, đặc biệt hai bên thân có hai dải
chấm màu da cam thể hiện khá rõ khi nhông bạnh nếp da hai bên sườn, còn
con cái các chấm vàng viền đen ở mặt lưng sắp thành bốn dãy dài chạy dọc
lưng từ sau gáy tới gốc đuôi, ngoài ra ở hai bên sườn không có các dãy chấm
màu da cam.
Về tính trạng khối lượng cơ thể, chiều dài thân thì cá thể đực thường
lớn hơn cá thể cái (cá thể đực có khối lượng trung bình là 41,17 g và chiều dài
thân trung bình là 114,0 mm; trong khi con cái là 30,52 g và 107,4 mm). Số
lượng lỗ đùi trung bình của cá thể đực ít hơn cá thể cái (con đực là 17 và con
cái là 18).
Đặc điểm hình thái của phân loài L.belliana guttata Cuvier cũng tương
tự như ở phân loài L.belliana belliana, chỉ khác ở một số tính trạng sau: Mặt
lưng của L.belliana guttata Cuvier không có các chấm vàng viền đen mà có
các chấm màu phân ngựa hình lục giác, có bốn sọc dài màu vàng nhạt rộng
trung bình 3 mm: hai sọc chạy từ sau tai đến gốc đuôi, hai sọc chạy từ gốc
chân trước đến gốc chân sau. Mặt bụng màu trắng đục, không có các chấm
màu da cam hai bên thân và không có khả năng bạnh da hai bên sườn.
L.belliana guttata Cuvier có khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g và
chiều dài thân trung bình là 120,83 mm. Số lượng lỗ đùi là 20 – 23
Ở Thừa Thiên Huế, nhông cát sinh sống ở hai vùng sinh cảnh khác
nhau là vùng cát ven biển và vùng nương rẫy ở đồng bằng các xã Thuỷ Phù,

o
C, độ ẩm trung
bình từ 83 – 92
o
C
Về vấn đề sinh sản của nhông cát, tác giả lưu ý một số vấn đề sau: “Đối
với loài nhông hoa, kích thước và khối lượng của tinh hoàn và của buồng
trứng vào các tháng IV và VI lớn hơn các tháng còn lại. Trong khi đó khối
lượng thể mỡ lại bé vào các tháng IV, V và VI và lớn hơn vào các tháng khác.
Đối với nhông sọc, khối lượng của buồng trứng vào các tháng IV, VI
và VII, trong khi khối lượng thể mỡ lại bé vào các tháng này và lớn hơn vào
các tháng khác.
Trứng có kích thước lớn hơn 4 mm chỉ thấy xuất hiện vào tháng IV và
VI ở phân loài nhông hoa và vào tháng IV, VI và VII ở phân loài nhông sọc.
Như vậy mùa sinh sản của nhông hoa là từ tháng IV đến tháng VI, của
nhông sọc là từ tháng IV đến tháng VII hàng năm. Đặc biệt, trong tất cả
những mẫu vật thu được ở Thuỷ Phù và Lộc Hải không có cá thể nào là đực
nên đưa đến khả năng nhông sọc là loài thằn lằn trinh sinh, tức là trứng phát
triển không có sự thụ tinh [4]. Tuy nhiên, tác giả cũng nhấn mạnh đây có phải
là loài trinh sinh hay không vẫn còn là vấn đề nghi vấn và cần tiếp tục theo
dõi.
9
II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ
1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước.
Trong những thập kỷ qua, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật phân tử,
phân loại học phân tử đã có những bước tiến bộ đáng kể. Đã có nhiều công
trình nghiên cứu về lĩnh vực này trên các đối tượng động vật, thực vật và vi
sinh vật. Những thành tựu này đặc biệt có ý nghĩa đối với những loài mới
được phát hiện hay với những loài đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên.
Việc nghiên cứu tính đa hình các cá thể trong một quần đàn, các quần

sừng lớn (Ovis canadensis) dựa trên phân tích 515 bp đầu tiên của vùng khởi
động ADN ty thể.
Nhiều nghiên cứu theo hướng đa dạng di truyền và nhận dạng các loài
ở mức phân tử cũng đã được tiến hành (Carvalho et al. 2001; Garrjardo et al.
2002)
2.Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về hai loài
nhông cát ở Thừa Thiên Huế. Tuy nhiên các công trình này chỉ nghiên cứu về
hình thái, đặc điểm sinh học, đặc điểm quần thể, sinh thái học cũng như hoạt
động ngày đêm của chúng (Ngô Đắc Chứng 1986, 1992, 1993, 1994). Ở Việt
Nam nói chúng phân loại phân tử vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ. Gần đây
một số công trình nghiên cứu theo hướng sử dụng các phương pháp sinh học
phân tử để phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ họ hàng của một số
loài đã được công bố.
Quyền Đình Thi và cộng sự (2003) đã sử dụng các kỹ thuật
microsatellite, mtRFLP, RAPD để phân tích đa hình của các quần thể đàn tôm
sú, cá tra nuôi ở Việt Nam. Nhóm nghiên cứu đã tìm được nhiều chỉ thị phân
tử đặc trưng như RAPD để phân biệt các quần đàn cá tra nuôi trong các trại cá
khác nhau. Những chỉ thị này có thể được nghiên cứu tiếp phục vụ công tác
chọn giống [13].
11
Nguyễn Thị Thanh Bình và cộng sự (2005) đã nghiên cứu đa dạng
phân tử của các giống tằm sử dụng trong sản xuất bằng PCR – RAPD. Cũng
bằng kĩ thuật này, Đinh Thị Phương Anh (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng
của thạch sùng vùng núi Bà Nà, Đà Nẵng [1,3].
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH
Có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình, mỗi phương pháp
đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không giống nhau nhưng có
thể bổ sung cho nhau để hoàn thiện kết quả nghiên cứu.
1. Phương pháp isoenzyme cổ điển

Chỉ thị ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình của ADN. Nó
có thể là những dòng gene có sẵn hay dưới dạng những thông tin di truyền
được lưu giữ và chuyển tải trong các file dữ liệu máy tính (ví dụ như trình tự
các mồi SSR, RAPD, AFLP). Người ta chia chỉ thị ADN thành 3 loại chính:
- Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết enzyme hạn chế (RFLP và
AFLP).
- Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên (RAPD).
- Chỉ thị dựa trên các trình tự ngắn lặp lại nhiều lần (tiểu vệ tinh)
2.1. Phương pháp RAPD
RAPD (Ramdon Amplified Polymorphism DNA) là các phân đoạn
DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên. Phương pháp này do William
(1990). Welsh và cộng sự (1991) phát triển từ phương pháp PCR chuẩn nhưng
với một mồi duy nhất có kích trước từ 5 đến 12 nucleotide. Do kích thước bộ
gen của một cá thể là rất lớn từ vài trăm triệu với vài tỉ base, là những chuỗi
13
được hình thành từ bốn base duy nhất là adenine, guanine, cytosine, và
thymine cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự 5 đến 12 base bắt cặp với trình tự
mồi ngẫu nhiên. Sản phẩm PCR với một mồi có trình tự ngẫu nhiên như vậy,
ở những điều kiện PCR nhất định sẽ cho một (hoặc vài) phân đoạn DNA
(khác nhau) trên điện di đồ.
Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có bộ gene giống nhau hoàn
toàn giống nhau. Kết quả điện di trên điện di đồ sẽ gồm những band vạch
DNA có kích thước như nhau. Khi bộ gen của chúng có nhiều trình tự khác
nhau, với một mồi ngẫu nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ cho
một số band vạch DNA có kích thước khác nhau trên điện di đồ.
Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể
trong một quần đàn, giữa các quần đàn trong cùng một loài hoặc giữa các loài
trong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp các nucleotide ra sao.
Mặt khác mồi RAPD sẽ chỉ ra một đa hình thường xuất hiện nhất [12].
Mồi ngẫu nhiên được thiết kế là những oligonucleotide có kích thước

base, dài 1000 bp, ngoại trừ sự đa hình sau: DNA
1
có trình tự GGATCC tại vị
trí bắt đầu với base 324, trong khi DNA
2
có trình tự GGTTCC đã bị thay thế
bởi GGTTCC cùng vị trí. Khi xử lý mỗi DNA đó với cùng một enzyme giới
hạn BamHI thì điều gì sẽ xảy ra với GGATCC? Kết quả điện di đoạn DNA
chỉ ra một sự khác nhau: với DNA
1
cho hai band vạch DNA, trong khi đó
DNA
2
chỉ cho một band vạch, BamHI không cắt DNA
2
do trình tự GGATCC
đã bị thay thế bởi GGTTCC. Vì vậy band chính khác từ một sự đa hình di
truyền rất nhỏ. Đó gọi là sự đa hình RFLP.
Khác với phương pháp RAPD, phương pháp RFLP phải dùng hai mồi
có những trìn tự nhất định để khuếch đại một phân đoạn DNA nào đó.
15
2.3. Phương pháp AFLP
AFLP là DNA đa hình phân đoạn được khuếch đại do Vos và cộng sự
tìm ra vào năm 1993. Là một kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên mà thực hiện
trong điều kiện phản ứng PCR nghiêm ngặt. Các mồi thường dài khoảng 17 –
21 nucleotide và có đầu mút giống nhau hoàn toàn. AFLP không bị ảnh hưởng
bởi các thông số khuếch đại (chu kỳ, nhiệt độ, nồng độ khuôn, chu kỳ PCR)
[12].
2.4. Microsatellite
Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequênc Repeats) là những trình tự

2.6. Phân tích ADN ty thể
Ty thể là bào quan có kích thước hiển vi phổ biến ở mọi sinh vật, cả vi
sinh vật hiếu khí. Chức năng chủ yếu của ty thể là trung tâm giải phóng năng
lượng của tế bào. Ty thể có đầy đủ các thành phần quan trọng như: ADN,
ARN, ATP và các hệ enzyme, do đó chúng có khả năng tự tổng hợp protein
đặc thù, cùng với lục lạp góp phần qui định tính di truyền của tế bào chất [11].
mtDNA ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng, kích thước khoảng 15-20
kb, trong đó bao gồm 13 gene mã hóa protein, 22 gene tRNA, 2 gen rRNA và
vùng không mã hóa dài khoảng 1000bp gọi là vùng điều khiển (vùng giàu A-
T ở động vật không xương sống và vùng D-loop ở động vật có xương sống, là
vùng không mã hóa duy nhất với các promoter để tái bản và phiên mã
mtDNA. mtDNA là vật chất di truyền nằm ngoài nhân, di truyền theo dòng
mẹ. Sự đa dạng mtDNA có thể sử dụng rộng rãi trong phân loại phân tử bởi
các đặc tính sau: (1) mtDNA có mặt ở hầu hết trong hệ gene động vật, (2) Tỷ
lệ tiến hoá của chúng nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì một gene nhân nào;
17
hơn nữa vùng điều khiển tiến hóa nhanh hơn 5-10 lần so với các vùng khác
của mtDNA. Vì vậy trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một
công cụ rất hữu hiệu để nghiên cứu mối quan hệ trong và giữa các quần đàn
cùng loài.
18