279

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, tập 71, số 2, năm 2012 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ THU NHẬN CHẾ PHẨM
PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA Bacillus amyloliquefacien N1
Đỗ Thị Bích Thủy
Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế

Tóm tắt. Một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thu nhận chế phẩm protease
ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens N1, phân lập từ nem chua Huế, như
thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và thời gian lên men đã
được nghiên cứu. Kết quả cho thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon bổ sung
vào môi trường cơ bản (MTCB), có chứa 1% petone, 0,3% cao thịt và 0,5% NaCl,
làm cho quá trình thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens
N1 tốt nhất; hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy đạt được 0,758 HP/ml, lớn
hơn so với mẫu đối chứng (0,613 HP/ml) 1,2 lần. Trong tất cả các nguồn nitơ bổ
sung vào MTCB, chỉ có casein làm cho hoạt độ protease (0,758 HP/ml) cao hơn
mẫu đối chứng (0,511 HP/ml). Các thí nghiệm có bổ sung kết hợp các nguồn nitơ
và carbon vào môi trường nuôi cấy, hoạt độ protease không tăng so với khi khảo sát
ảnh hưởng riêng rẽ nguồn tinh bột. Trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng
tinh bột (0,25%-1,75%) đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng này, hoạt
độ quan sát đạt được giá trị cao nhất (0,760 HP/ml) ở hàm lượng tinh bột 0,75%.
Môi trường nuôi cấy có thành phần thích hợp cho quá trình thu nhận chế phẩm
protease ngoại bào B. Amyloliquefaciens N1 được gọi là môi trường thích hợp
(MTTH). Nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens N1 trong MTTH, hoạt độ protease
đạt cao nhất ở pH ban đầu bằng 8 và nhiệt độ 35
o

1995) , nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫn còn hạn chế. Hiện nay, trong nước chưa có
cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme, các chế phẩm sử dụng trong nước đều phải nhập
ngoại.
Từ chủng Bacillus amyloliquefacien N1 phân lập từ nem chua Huế có khả năng
sinh tổng hợp protease ngoại bào cao, trong công trình này, chúng tôi tiếp tục nghiên
cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease ngoại bào của nó như
thành phần môi trường, nhiệt độ, pH ban đầu và thời gian nuôi cấy. Kết quả này sẽ làm
tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm thiết lập được quy trình sản xuất chế
phẩm protease ngoại bào từ B. amyloliquefaciens N1 có hiệu quả kinh tế cao.
2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Chủng Bacillus amyloliquefacien N1 phân lập từ nem chua có khả năng
sinh tổng hợp protease ngoại bào cao được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công
nghệ vi sinh, Viện Tài nguyên môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme
Phân phối 0,5 ml dịch canh trường vào bình tam giác dung tích 100 ml có chứa
20 ml môi trường. Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ ở 35
o
C. Dịch môi trường
nuôi cấy có chứa enzyme được thu nhận bằng cách ly tâm tách tế bào ở 14.000
vòng/phút, nhiệt độ 4
o
C trong 10 phút.
2.2.2. Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến
Nguyên tắc của phương pháp là định lượng sản phẩm tạo thành do quá trình
thủy phân cơ chất casein của protease bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Hỗn hợp 281

4
Cl, casein, cao nấm, urê) vào
MTCB. Mỗi nguồn bổ sung 0,5%. Sau đó, tiến hành phối hợp nguồn cacbon có tác dụng
kích thích vi khuẩn sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất với các nguồn nitơ khác;
đồng thời khảo sát kết hợp nguồn nitơ kích thích vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme ngoại
bào cao nhất với các nguồn carbon khác. Xác định hoạt độ protease trong dịch môi
trường thu được sau khi nuôi cấy bằng phương pháp Anson cải tiến. Môi trường có
thành phần thích hợp cho vi khuẩn sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất được gọi
là môi trường thích hợp (MTTH).
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1
B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy để thu nhận enzyme trong MTTH có
pH ban đầu thay đổi trong khoảng 5-11. Hoạt độ proease trong dịch môi trường thu
được sau khi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến.
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1
Quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens
N1 được thực hiện trong MTTH và pH ban đầu thích hợp. Nhiệt độ nuôi cấy được
thay đổi trong các mẫu thí nghiệm từ 30
o
C đến 60
o
C. Hoạt độ protease trong môi
trường sau khi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến.
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1 282


t đ

(HP/ml)

Nguồn carbon (0,5%)
c
0,581
0,542
0,656
0,758
0,613
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Glu Sac Lac TB ĐC283

trường, hoạt độ protease trong môi trường thấp hơn so với mẫu đối chứng. Sangeetha
và cộng sự (1999) cũng công bố saccharose, glucose có tác dụng kìm hãm hoạt độ
protease của Bacillus sp Trái lại, Ravichandra và đồng tác giả (2007) và Sangeetha và
đồng tác giả (2008) cho rằng glucose có khả năng kích thích sự sinh enzyme mạnh nhất.
Nguồn lactose cũng có kích thích chủng này sinh tổng hợp protease ngoại bào nhưng

b
e
Nguồn N (0,5%)
NH
4
Cl
0,502
0,222
0,012
0,567
0,511
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Ure CN Cas ĐC284

giảm ít hơn so với các nguồn nitơ vô cơ. Điều này trái ngược với nghiên cứu của
Robert và đồng tác giả (2008) trên chủng Bacillus pumilus SG2 xác định cao nấm
men là nguồn nitơ tốt nhất. Điều này có lẽ là do enzyme ngoại bào được tiết ra môi
trường từ mỗi loài vi sinh vật có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau nên đòi hỏi các chất
cảm ứng khác nhau.
3.3. Ảnh hưởng kết hợp của nguồn carbon và nitơ lên khả năng sinh protease
ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1

0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
TB+CN
TB+Urê
TB+
TB+Cas
TB
Cas+Glu
Cas+Lac
Cas+Sac
Cas
e
f
d
d
c
c
b
a a
B
ổ
sung các ngu
ồ
n dinh dư
ỡ

m l
ượ
ng tinh b
ộ
t (%)

d
c
b
c
e
f
0,631
0,737
0,760
0,655
0,654
0,627
0,618
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,25% 0,50% 0,75% 1% 1,25% 1,50% 1,75%


e
f

0,639
0,771
0,637
0,517
0,081
0,061
0,004
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
30 35 40 45 50 55 60
Hoạt độ (HP/ml)
pH ban đ
ầ
u c
ủ
a môi trư
ờ
ng
C khi
nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 ở khoảng 30 – 60
o
C (Hình 6). Trong điều kiện nuôi cấy
ở nhiệt độ 30
o
C, 40
o
C hoạt độ protease chỉ bằng 0,84 và 0,82 lần so với hoạt độ protease
ở 35
o
C. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ 45
o
C, hoạt độ protease giảm chỉ còn 0,517 HP/ml; nhiệt
độ từ 50
o
C trở lên giảm hẳn đặc biệt ở nhiệt độ 60
o
C hoạt độ gần như không có. Điều
này có lẽ là khi nhiệt độ càng lên cao enzyme ngoại bào protease bị bất hoạt, đồng thời
các enzyme nội bào xúc tác các quá trình trao đổi chất của tế bào cũng bị ảnh hưởng nên
vi khuẩn không thực hiện quá trình sinh tổng hợp protein được. Đã có nhiều công trình
được công bố khác nhau về ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp
protease của vi khuẩn. Rai và Ashis (2010) cho kết quả nhiệt độ thích hợp là 37 - 45
o
C;
Kết quả nghiên cứu của Yong và đồng tác giả (2004) và Mussarat và đồng tác giả
(2008) là 50
o
C; trong khi đó Wang và đồng tác giả (2006) công bố là 55

0.289
0.430
0.580
0.777
0.561
0.428
0.356
0.293
0.203
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72288

các chất dinh dưỡng giảm làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzyme bị bất hoạt.
Hơn nữa, đối với protease còn xảy ra hiện tượng autolysis (hiện tượng enzyme tự
thủy phân chúng) hoặc do vi sinh vật tổng hợp nên các chất kìm hãm trong môi
trường làm cho hoạt độ protease giảm.
4. Kết luận
- Thành phần môi trường thích hợp để thu nhận chế phẩm protease ngoại bào

Chemistry, 4(2), (2007), 145-153. 289

8. Gessesse A, Hatti-Kaul R, Gashe B A, Mattiasson B., Novel alkaline proteinases from
alkaliphilic bacteria grown on chicken feather, Enzyme and Microbial Technology, 32,
(2002), 519-524.
9. Joo HS, Kumar CG, Park GC, Kim KT, Paik SR, Chang Cs., Optimization of the
production of an extracellular alkaline proteinase from Bacillus horikoshi, Process
Biochem, 38, (2002), 155-159.
10. Kim J M, Lim W J, Suh H J., Feather-degrading Bacillus species from poutry waste,
Process Biochemistry, 37, (2001), 287-291.
11. Mehrotra S, Pandey P K, Gaur R, Darmwa N S., The production of alkaline proteinase
by Bacillus species isolate, Bioresource Technology, 67, (1999), 201-203.
12. Mussarat S, Aamer AS, Abdul H, Fariha H., Influence of culture condition on
production and activity of protease from Bacillus subtilis BS1, Parkistan J of Microbiol,
40 (5), (2008), 2161-2169.
13. Rai SK, Ashis KM., Statistical optimization of production, purification and industrial
application of a laundry detergent and organic solvent-stable subtilisin-like serine
protease (Alzwiprase) from Bacillus subtilis DM-04. Biochem Eng J, 48 (2), (2010),
173-180.
14. Robert S, Geetha A & Arulpandi I., Optimization of protease and lipase production by
Bacillus pumilus SG2 isolated from an industrial effluent, The Internet Journal of
Microbiology, 5(2), (2008), 2161-2169.
15. Sangeetha M, Pandey PK, Gaur R, Darmwal NS., The production of alkaline
proteinase by Bacillus species isolated, Bioresoure Technology, 67, (1999), 201-203.
16. Sangeetha M, Pandey PK, Gaur R, Darmwal NS., The production of alkaline
proteinase by Bacillus species isolated, Bioresoure Technology, 67, (1999), 201-203.
17. Sivasubramanian S, Manohar BS, Puvanakrishnan R., Mechanism of enzymatic

Results showed that in the base culture medium (BCM), which containing 1% of
peptone, 0,3% of meat extract and 0,5% of NaCl, added soluble starch the
extracellular protease production of Bacillus amyloliquefaciens N1 with highest
activity (0,758 HP/ml) compared to the other carbon sources. This value was
significant higher (p<0,05) than control sample (0,613 HP/ml) by 1,2 times.
Besides, the addition of casein into BCM showed that protease activity (7.267
U/ml) was higher than control sample ((0,511 HP/ml). Moreover, the results
indicated that the combination of two nutrients (carbon and nitrogen) into BCM did
not increase the protease activity of Bacillus amyloliquefaciens N1 compared to the
separated addition of solution starch. Therefore, the effects of soluble starch
concentrations (from 0,25% to 1,75%) were studied. The highest protease activity
was 0,760 HP/ml at 0,75% soluble starch concentration. The new optimal medium
(NOM) therefore contains 1% of peptone, 0,3% meat extract, 0,5% NaCl and
0,75% solution starch. When growing the Bacillus amyloliquefaciens N1 in NOM,
the highest protease activity of with initial pH (8), temperature (35
0
C) and after 32
hours fermentation were 0,777 HP/ml.
Keywords: Bacillus amyloliquefaciens, culture temperature, medium, production,
protease.