BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
**********
KHỔNG TRỌNG QUÂN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU
THỰC NGHIỆM CỦA STEPHANIA SINICA
DIELS. VÀ STEPHANIA DIELSIANA Y.C. WU,
HỌ TIẾT DÊ MENISPERMACEAE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHỔNG TRỌNG QUÂN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU

Dược lực, TS. Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dược liệu, TS. Nguyễn Quốc Huy,
Bộ môn Thực vật, trường ĐH Dược Hà Nội.
Là những người thầy, người cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Đinh Đại Độ, kỹ thuật viên tại bộ môn Dược
lực trường ĐH Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và trực tiếp thực hiện nhiều công
việc xuyên suốt trong quá trình tiến hành đề tài.
Nhân đây em cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
Các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược lực đã tạo mọi
điều kiện, giúp đỡ để em có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất.
Các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các bộ môn
trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong quá trình học tập
tại trường.
Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia
đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình
học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Khổng Trọng Quân
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2.2.7.Đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình ETM 21
2.2.8.Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental. 22
2.3.Xử lý số liệu 23
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24
3.1.Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần S. dielsiana và
S. sinica 24
3.1.1.Trên mô hình EPM ở chuột không chịu stress 24
3.1.2.Trên mô hình EPM ở chuột chịu stress do cô lập 26
3.1.3.Trên mô hình ETM 28
3.2. Đánh giá tác dụng an thần của dịch chiết nước toàn phần của S. dielsiana
và S. sinica 29
3.2.1.Trên chuột không chịu stress 29
3.2.2.Trên chuột chịu stress do cô lập 30
3.3. Đánh giá tác dụng giải lo âu và an thần của alcaloid toàn phần từ S.
dielsiana và S. sinica 31
3.3.1. Chiết xuất alcaloid từ củ 2 loài Stephania 31
3.3.2.Đánh giá tác dụng giải lo âu của alcaloid toàn phần từ S. dielsiana và S.
sinica 32
3.3.3.Đánh giá tác dụng an thần của alcaloid toàn phần từ 2 loài Stephania 35
3.4.Bàn luận 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Akt
Protein kinase B
BDNF
Yếu tố kích thích thần kinh đến từ não (Brain-derived

Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder)
SPD

Stepholidin
THP
Tetrahydropalmatin
Rf Hệ số lưu
MeOH Methanol

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng Trang

1.1
Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Nguyễn Tiến Vững)
3
1.2
Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Lã Đình Mỡi)
4
1.3
Kết quả định lượng THP (Nguyễn Tiến Vững)
4
1.4
Kết quả định lượng THP (Lã Đình Mỡi)
5
1.5

33
3.7
Tác dụng của alcaloid toàn phần, diazepam và tetrahydropalmatin
trên số lần vào tay kín và thời gian lưu tại tay kín, tay mở của chuột
không chịu stress trên mô hình EPM
34 DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình Trang

1.1
Sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid toàn phần của 6 loài thuộc chi
Stephania Lour. (UV 254 và 365 nm)
6
2.1
Hình ảnh củ loài Stephania sinica Diels.
15
2.2
Hình ảnh củ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu.
15
2.3
Hình ảnh chuột nuôi cô lập để gây stress
19
2.4
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn lo âu (anxiety disorders) là sự lo sợ quá mức trước một tình huống
xảy ra, có tính chất vô lý, lặp lại và kéo dài gây ảnh hưởng đến sự thích nghi với
cuộc sống của người bệnh. Đây là một trong những rối loạn tâm lý có tính phổ biến
cao, có xu hướng ngày càng gia tăng, thường kết hợp với nhiều rối loạn khác như
mất ngủ, trầm cảm, rối loạn ăn uống, rối loạn hành vi [14]. Hiện nay, phương pháp
điều trị rối loạn lo âu chủ yếu là phối hợp liệu pháp tâm lý với thuốc giải lo âu
(anxiolytics). Các thuốc giải lo âu có nguồn gốc hóa dược chính được sử dụng là
các dẫn chất của benzodiazepin, buspiron và các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn
lọc tái thu hồi serotonin hoặc chống trầm cảm 3 vòng [17]. Hạn chế lớn nhất của các
thuốc có nguồn gốc hóa dược là tác dụng phụ, khả năng lệ thuộc thuốc và phản ứng
cai thuốc xảy ra khi dừng điều trị. Thêm vào đó, giá thành cao của các thuốc này
cũng là vấn đề cần quan tâm khi sử dụng thuốc hàng ngày trong một thời gian dài
cho bệnh nhân. Vì vậy, sử dụng các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dược liệu hiện
được coi là hướng tiếp cận bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hóa
dược trong điều trị rối loạn lo âu [47].
Chi Stephania Lour. là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Tiết dê
(Menispermaceae) với khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới của châu Á, châu Phi và châu Úc. Trong lĩnh vực dược lý thần kinh và tâm
thần, nghiên cứu về các loài trong chi chủ yếu tập trung trên tác dụng chống loạn
tâm thần, hướng điều trị Alzheimer, an thần và giải lo âu. Nhiều nghiên cứu hóa học
và dược lý đã được thực hiện để làm sáng tỏ các hướng tác dụng trên trong đó nhiều
alkaloid có hoạt tính sinh học đã được phân lập và xác định cấu trúc [48].
Tại Việt nam, các loài của chi Stephania Lour. được nghiên cứu khá đầy đủ
về hóa học và tác dụng sinh học hướng an thần trên cơ sở chiết tách L-


3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Chi Stephania Lour.: Thành phần hóa học và các tác dụng dược lý tâm
thần/thần kinh
1.1.1. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của chi Stephania Lour. gồm có alcaloid, flavonoid, tinh
bột, đường khử, acid malic, enzym oxydase Trong đó alcaloid là thành phần chính
và được quan tâm nhiều nhất [48]. Các alcaloid đã phân lập từ các loài trong chi
Stephania Lour. có thể xếp vào 9 nhóm: benzylisoquinolin, bisbenzylisoquinolin,
aporphin, proaporphin, protoberberin, morphinan, hasubanan, stephaoxocan và
eribidin [6]. Trong số này L-tetrahydropalmatin (THP) là alcaloid được nghiên cứu
nhiều nhất để phát triển ứng dụng sản xuất thuốc an thần, gây ngủ.
1.1.2. Hàm lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong các loài bình
vôi ở Việt Nam
1.1.2.1. Alcaloid toàn phần
Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững đã công bố hàm lượng alcaloid toàn phần từ
3 loài bình vôi nghiên cứu như sau :
Bảng 1.1: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Nguyễn Tiến Vững)
Stt Loài Nơi thu hái Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)

1 S. glabra(Roxb.) Miers

Ninh Bình 2,96
2 S. kuinanensis H.S.Lo Lạng Sơn 4,41
3 Stephania sp3. Quảng Ninh

2,32

3 Stephania sp3. 1,52
Năm 2000, Lã Đình Mỡi đã khảo sát hàm lượng THP trong 5 loài bình vôi
nghiên cứu : 5 Bảng 1.4: Kết quả định lượng THP (Lã Đình Mỡi)
Stt Loài
Hàm lượng
THP (%)
Hàm lượng
THP/alcaloid toàn
phần (%)
1 S. brachyandra Diels. 5,1 50,1
2
S. glabra (Roxb.)
Miers
2,1 50,0
3 S.sinica Diels. 1,4 46,4
4 S.kwangsiensis H.S.Lo 1,8 50,5
5 S.hainanensis H.S.Lo 0,6 18,3
Vũ Xuân Giang đã xác định hàm lượng THP và palmatin trong loài S.
viridiflavens H.S. Lo thu hái ở Sơn La là: 0,63% và 0,32% . Phạm Thị Duyên (2004)
đã nghiên cứu định lượng THP bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
cho thấy hàm lượng THP trong loài S. dielsiana (thu hái ở Ba Vì-Hà Tây), loài S.
viridaflavens (thu hái ở Sơn La) và Stephania sp. (trong viên Balok) lần lượt là:
0,40%; 0,62% và 1,63%. Đỗ Phương Loan đã xác định hàm lượng THP của loài S.
brachyandra Diels. ở củ là 3,7% và ở thân là 0,67%.

tyrosinhydroxylase, điều hòa giải phóng dopamin và có hiệu quả chống loạn thần
trên mô hình gây tâm thần phân liệt ở động vật thực nghiệm [52]. Trên lâm sàng,
giúp cải thiện cả triệu chứng âm tính và dương tính ở bệnh nhân tâm thần phân liệt
đồng thời ít gây tác dụng ngoại tháp [52]. Bi-acetylated l-stepholidine, một dẫn chất
7 có sinh khả dụng tốt hơn SPD, với đặc tính chủ vận trên receptor D
1
và receptor 5-
HT
1A
,

đối kháng trên receptor D
2
, làm giảm kích thích và cải thiện chức năng vận
động, nhận thức ở chuột cống trong mô hình gây tâm thần phân liệt thực nghiệm bởi
phencyclidin [25].
Tetrahydropalmatin (THP), một alcaloid được tìm thấy ở hầu hết các loài
thuộc chi Stephania, có ái lực gắn cao với receptor α
1A
và α
2A
-adrenergic, D
1
, D
2
và
D

nghiện cocain và heroin trên thực nghiệm ở chuột cống [53]. THP ức chế sự phụ
thuộc tâm thần gây ra bởi oxycodon thông qua ảnh hưởng tới sự phosphoryl hóa
CREB (cyclic-AMP response element-binding protein) và ERK (Extracellular
signal-regulated kinases) ở nhân vòng và hồi hải mã (hippocampus) ở chuột cống
[35].
Theo hướng tiếp cận sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế
acetylcholinesterase có tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer, dịch chiết củ loài
S. suberosa Forman. nồng độ 0,1 mg/ml ức chế trên 90% hoạt tính
actetylcholinesterase [29]. Ba alkaloid protoberberin (stepharanine, cyclanoline và
N-methyl stepholidine) phân lập từ loài S. venosa (Blume) Spreng. có hoạt tính ức
chế mạnh acetylcholinesterase (tiềm năng trong điều trị sa sút trí tuệ và bệnh
Alzheimer) với giá trị IC
50
tương ứng là 14,1; 9, 23 và 31,3 M [28]. Tetrandrin
được chiết xuất và phân lập từ loài S. tetrandrae S. Moore ức chế hoạt động của
NF-κB, giảm đáng kể sự tạo thành các yếu tố gây viêm IL-1β và TNF-α, bảo vệ tế
bào thần kinh khỏi độc tính gây ra bởi amyloid-β protein, cải thiện tình trạng sa sút
trí nhớ và giảm khả năng học nhớ trên chuột cống (mô hình mê cung nước Morris),
8 tạo tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer [27]. Nhờ đặc tính chủ vận trên
receptor D
1
và đối kháng trên receptor D
3
, SPD làm giảm nhẹ rối loạn vận động ở
bệnh nhân mắc bệnh Parkinson [52].
Dịch chiết nước của 3 loài S. baicalensis, S. tetrandra, S. miltiorrhiza ức chế
receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA), có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh tạo

9 của THP thông qua, ít nhất một phần, tương tác với vị trí gắn của benzodiazepin
trên receptor GABA
A
[26], [32]. Nguyễn Tiến Vững đã tiến hành thăm dò tác dụng
của l-THP trên điện não thỏ. Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện cực vào vùng
cảm giác, vận động và thể lưới thân não. Sau khi cho thỏ uống l-THP với liều
100mg/kg thể trọng trong 7 ngày, thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng
cảm giác-vận động và trong thể lưới thân vỏ não có những biến động rõ. Sự tăng
thành phần sóng chậm delta và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng l-
THP có tác dụng tăng cường ức chế tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại não và thể
lưới thân não [16]. Phạm Duy Mai và cộng sự cũng đã nghiên cứu tác dụng an thần
của THP, kết quả cho thấy gindarin hydroclorid (l-THP hydroclorid) mức liều
30mg/kg và 100mg/kg có tác dụng kéo dài thời gian ngủ gấp do thiopental gấp 1.5
lần so với nhóm chứng (trích theo Nguyễn Quốc Huy [6]). Cũng theo Nguyễn Tiến
Vững, l-THP liều 40mg/kg kéo dài thời gian ngủ do pentobarbital gấp 8 lần so với
nhóm chứng [16].
1.2. Về hai loài Stephania dielsiana Y.C.Wu và Stephania sinica Diels.
1.2.1. Đặc điểm thực vật
Stephania dielsiana Y.C.Wu.: Tên thường dùng: Củ dòm. Tên khác: Bình
vôi nhựa tím, cà tòm (Tày, Tuyên Quang), củ gà ấp. Phân bố: Lào Cai, Yên Bái,
Bắc Cạn, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh,
Quảng Ninh. Dây leo nhỏ, sống nhiều năm. Rễ củ to. Thân leo cuốn dài khoảng 3m.
Thân non màu tím hồng nhạt. Ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím
hồng. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực do 3-5 xim nhỏ hợp thành xim tán kép.
Hoa nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình quạt tròn,
màu vàng cam. Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô. Cụm hoa cái gồm 7-8
đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu. Hoa nhỏ; đài 1, màu tím hồng; cánh

O
OCH
3
OCH
3
N
CH
3

N
+
O
N
O
O
O
CH
3
H
3
CO
H
3
CO
CH
3
H

2 3
11

OH
OCH
3
O
N-CH
3

5
Với S.dielsiana hiện có 15 alcaloid đã được phân lập từ củ của loài này, bao
gồm : dehydrostesakin (6), oxocrebanin (7), 1,2 – methylen-dioxy- 8 – methoxy- 7
– oxodibenzoquinolin (8), l-tetrahydropalmatin, oxostephanin (9), dehydrocrebanin
(10), ayuthianin (11), cephamorphinanin (12), aknadinin (13), liriodenin (14),
(-) corydalmin, nor-canelillin (15), sinomenin, stephanin (16), dehydrostephanin
(17), crebanin (18) [6], [11], [21], [56].
12 N
O
O
CH
3
OCH
3
OH

N

OCH
3
H
3
CO
H
3
CO
H
OCH
3

N
O
O
H
3
CO
H
O
CH
3

1 9
O
O
H
3
CO
OCH

OH
N-CH
3
H
3
CO

12 13
N
O
O
O

N
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
OH
H

14 4
NH
OH
H
3

CH
3

16 17
14 1.2.3. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý hướng thần kinh và tâm thần
Tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Pubmed/Medline với các từ khóa Stephania
sinica Diels. và Stephania dielsiana Y.C. Wu. chưa tìm thấy bất cứ công bố nào về
tác dụng sinh học liên quan đến tác dụng an thần và giải lo âu của hai loài công bố
bởi các tác giả nước ngoài.
Trong nước, Nguyễn Quốc Huy và cộng sự đã xác định được liều LD
50
của
củ loài S. dielsiana là 22,2 g/kg và thử tác dụng chống viêm và giảm đau thực
nghiệm của loài này [8]. Theo đó, cả 2 mức liều 2,5 g/kg và 5 g/kg đều không có tác
dụng giảm đau theo cơ chế trung ương theo phương pháp gây đau bằng mâm nóng.
Theo hướng tiếp cận sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế acetylcholinesterase có
tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer, Đỗ Quyên và cộng sự đã phát hiện dịch
chiết methanol của Stephania sinica có tác dụng ức chế mạnh nhất enzym này (hoạt
độ ức chế 85% ở nồng độ 250 g/ml) đồng thời phân lập được 2 alkaloid là l-
tetrahydropalmatin và sinomenin trong phân đoạn có tác dụng [13]. Quan sát ban
đầu của Phạm Thanh Kỳ và Nguyễn Quốc Huy cho thấy từ mức liều 2,5 g/kg dịch
chiết dược liệu S. dielsiana đã quan sát thấy sự giảm hoạt động của chuột. Dịch
chiết dược liệu có tác dụng kéo dài thời gian ngủ do thiopental gấp 3 lần và 8 lần so
với nhóm chứng khi dùng liều tương ứng 1,25 g/kg và 2,5 g/kg [10].

Bơm, kim tiêm nhựa, đồng hồ bấm giây, cân phân tích, cân kỹ thuật.
16 Cốc có mỏ 100, 250 ml, ống đong 50, 100 ml, chày, cối và một số dụng cụ
dùng trong chăn nuôi và pha chế của bộ môn Dược lực, trường ĐH Dược Hà Nội.
2.1.3. Động vật thực nghiệm
+ Chuột nhắt trắng giống đực, chủng Swiss albino khỏe mạnh, khối lượng
trung bình 18-22 g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.
+ Chuột cống trắng cả 2 giống, chủng Wistar, khối lượng 200-250 g do Học
viện Quân Y cung cấp. Chuột được chia lô ngẫu nhiên 8-10 con/lô, nuôi trong điều
kiện nhiệt độ 24±1
o
C, ánh sáng tự nhiên, được nuôi bằng thức ăn chuẩn, uống nước
tự do.
2.1.4. Chuẩn bị thuốc thử
+ Chiết alcaloid: chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm theo
Dược Điển Việt Nam IV [3].
Cân chính xác khoảng 30,0 (g) bột dược liệu chuyển vào một túi giấy lọc.
Thấm ẩm bằng dung dịch amoniac 6N (TT), để yên trong 40 phút. Chuyển túi giấy
lọc vào bình Soxhlet, thêm 200 ml cloroform (TT), chiết tới khi dịch chiết lắc với
acid sulfuric cho phản ứng âm tính với thuốc thử Mayer thì dừng lại. Lấy dịch chiết
cô cách thủy tới cắn, hòa tan hoàn toàn cắn trong dung dịch acid sulfuric 5N (TT).
Lọc qua giấy lọc vào bình gạn. Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac đậm đặc (TT) đến
pH 10. Chiết bằng cloroform 4 lần. Gộp dịch chiết cloroform, bốc hơi cách thủy đến
cắn khô.
+ Dịch chiết toàn phần trong nước thu được bằng phương pháp sắc với dung
môi là nước, bay hơi dung môi đến dạng cao lỏng 1:1.
+ Dạng hỗn dịch: phân tán diazepam, rotundin, cắn alcaloid trong CMC
0,5% theo tỷ lệ thích hợp rồi pha loãng bằng nước cất để đạt nồng độ mong muốn.

dielsiana
Dịch chiết nước toàn phần Alcaloid toàn phần
An thần, chuột
không chịu
stress

Giải lo âu, chuột
không chịu
stress,
EPM

Giải lo âu,
chuột chịu
stress, EPM
Giải lo âu,
chuột không
chịu stress,
ETM
An thần,
chuột chịu
stress
Giải lo
âu, chuột
không
chịu
stress,
EPM

An thần,
chuột