tên đề tài.txt
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước từ hoa bụp giấm (Hibiscus
Sabdariffal) và ứng dụng trong sản xuất sữa chua Kefir
(Giảng Viên Hướng Dẫn: Th.S Phạm Minh Nhựt)
SV: Phạm Thị Thảo Vy
Lớp: 13DSH04
MSSV: 131100877

Page 1


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở
lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh
Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố
trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan
này.
Tp.Hồ Chí Minh, ngày…..tháng…..năm…..
Sinh viên

Phạm Thị Thảo Vi


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học
Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý
báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.

Tên gọi và phân loại ............................................................................................ 4

1.1.2.

Phân loại thưc vật ................................................................................................ 4

1.1.3.

Mô tả thực vật ..................................................................................................... 4

1.1.4.

Phân bố ................................................................................................................ 5

1.1.5.

Giá trị sử dụng của cây bụt giấm ........................................................................ 5

1.1.6.

Thành phần hóa học của bụt giấm ...................................................................... 6

1.1.7.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ......................................................... 6

1.1.7.1. Tình hình nghiên cứu trong nước........................................................................ 6
1.1.7.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới...................................................................... 7
1.2.



Đồ án tốt nghiệp

1.3.2.1. Sữa là hệ phân tán cao....................................................................................... 18
1.3.2.2. Độ chua của sữa ................................................................................................ 18
1.3.2.3. Tính oxi hoá khử của sữa .................................................................................. 18
1.3.2.4. Khối lượng riêng ............................................................................................... 18
1.3.2.5. Áp suất thẩm thấu và nhiệt độ đóng băng ......................................................... 18
1.3.2.5. Tính kháng khuẩn.............................................................................................. 19
1.3.3.

Thành phần hóa học của sữa ............................................................................. 19

1.3.3.1. Đường lactose ................................................................................................... 20
1.3.3.2. Chất béo ............................................................................................................ 21
1.3.3.3. Protein ............................................................................................................... 22
1.3.3.4. Khoáng .............................................................................................................. 23
1.3.3.5. Vitamin .............................................................................................................. 23
1.3.3.6. Hormone ............................................................................................................ 23
1.3.3.7. Các hợp chất khác ............................................................................................. 24
1.4.

Kefir và quá trình lên men tạo sữa chua của hạt kefir ...................................... 24

1.4.1.

Khái niêm về sữa chua kefir ............................................................................. 24

1.4.2.


1.4.6.1. Sơ đồ sản xuất sữa chua bằng hạt Kefir ............................................................ 40
1.4.6.2. Thuyết minh quy trình sản xuất sữa chua bằng hạt Kefir ................................. 41
1.4.7.

Phương pháp bảo quản và phục hồi hoạt động của hạt kefir ............................ 42

1.4.7.1. Phương pháp bảo quản hạt kefir ....................................................................... 42
1.4.7.2. Phục hồi hoạt động của hạt kefir....................................................................... 43
CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 45
2.1.

Địa điểm và thời gian ........................................................................................ 45

2.1.1.

Thời gian tiến hành thí nghiệm ......................................................................... 45

2.1.2.

Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 45

2.2.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 45

2.2.1.

Nguồn mẫu ........................................................................................................ 45

2.2.2.


Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật............................................. 48

2.3.2.1. Nguyên tắc ........................................................................................................ 48
2.3.2.2. Cách tiến hành ................................................................................................... 48
2.3.3.

Phương pháp cấy truyền vi sinh vật .................................................................. 49

2.3.3.1. Nguyên tắc ........................................................................................................ 49
2.3.3.2. Cách tiến hành ................................................................................................... 49

iii


Đồ án tốt nghiệp

2.3.4.

Phương pháp bảo quản lạnh sâu........................................................................ 49

2.3.4.1. Nguyên tắc ........................................................................................................ 49
2.3.4.2. Cách tiến hành ................................................................................................... 50
2.3.5.

Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị .................. 50

2.3.5.1. Nguyên tắc ........................................................................................................ 50
2.3.5.2. Cách tiến hành ................................................................................................... 50
2.3.6.

2.4.2.

Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước bụt giấm

trên các chủng vi khuẩn gây bệnh. ................................................................................. 59
2.4.2.1. Quy trình thí nghiệm ......................................................................................... 59
2.4.2.2. Thuyết minh quy trình....................................................................................... 61

iv


Đồ án tốt nghiệp

2.4.3.

Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết nước từ

hoa bụt giấm đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. ..................................................... 62
2.4.3.1. Quy trình thí nghiệm ......................................................................................... 62
2.4.3.2. Thuyết minh quy trình....................................................................................... 64
2.4.4.

Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng nhân sinh khối của hạt kefir trên một số môi

trường... .......................................................................................................................... 64
2.4.4.1. Mục đích ........................................................................................................... 64
2.4.4.2. Cách tiến hành ................................................................................................... 64
2.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................ 65
2.4.5.




Đồ án tốt nghiệp

2.4.8.3. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................ 68
2.4.9.

Thí nghiệm 9: Khảo sát tỷ lệ cao chiết nước bổ sung vào sản phẩm ................ 69

2.4.9.1. Mục đích ........................................................................................................... 69
2.4.9.2. Cách tiến hành ................................................................................................... 69
2.4.9.3. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................ 69
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 70
3.1.

Kết quả đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết nước bụt giấm. ........................ 70

3.2.

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước bụt giấm trên các chủng vi

khuẩn gây bệnh. ............................................................................................................. 70
3.3.

Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của cao chiết nước từ hoa bụt

giấm đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. ................................................................... 73
3.4.

Kết quả khảo sát khả năng nhân sinh khối của hạt kefir trên một số môi


Kiến nghị ........................................................................................................... 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 88

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
DNA: Deoxyribonucleic acid
MBC: Minimal Bactericidal Concentration: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu
RNA: Ribonucleic acid
TSA: Trypton Soya Agar
TSB: Trypton Soya Broth

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan,
1999)……... ................................................................................................................... 10
Bảng 1.2 Mối liên hệ giữa các đơn vị đo độ chua của sữa ............................................ 18
Bảng 1.3 Thành phần của một số loại sữa ..................................................................... 19
Bảng 1.4 Các thành phần chính của một lít sữa ............................................................. 19
Bảng 1.5 Các vi sinh vật có trong hạt Kefir (Oberman H và cộng sự, 1998) ................ 28

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của berberine ....................................................................... 16
Hình 1.8 Sữa tươi .......................................................................................................... 17
Hình 1.9. Sơ đồ tóm lược chuyển hóa các chất trong quá trình lên men sữa ................ 37
Hình 1.10 Thành phần môi trường trước và sau khi lên men ........................................ 39
Hình 1.11 Sơ đồ sản xuất sữa chua bằng hạt Kefir ........................................................ 41
Hình 1.12 Hạt kefir đươc bảo quản đông lạnh(-150C) ................................................... 43
Hình 2.1 Mẫu atiso đỏ phơi khô đến khối lượng không đổi ........................................ 48
Hình 2.2 Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................................... 51
Hình 2.3 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn của cao nước và Ciprofloxacin ................ 53
Hình 2.4. Quy trình nghiên cứu sản xuất sữa chua kefir bụt giấm ................................ 55
Hình 2.5 Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ bụt giấm .............................................. 57
Hình 2.6 Mẫu bụt giấm sau khi được phơi khô và xay nhỏ ........................................... 58
Hình 2.7 Dich chiết mẫu sau 3 lần ngâm ....................................................................... 59
Hình 2.8 Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết ............................... 60
Hình 2.9 Giếng thạch trước và sau khi bổ sung cao ...................................................... 61
Hình 2.10 Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết................ 63
Hình 3.1 Đồ thị thể hiện sinh khối (g) của hạt kefir trong các môi trường sau 24, 48h
lên men ở nhiệt độ phòng ............................................................................................... 76

ix


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Đồ thị thể hiện độ 0T của sản phẩm lên men ở nhiệt độ phòng với 3 tỷ lệ cấy
giống 5%, 7%, 9% .......................................................................................................... 78
Hình 3.3 Đồ thị thể hiện hoạt lực lên men (0T) của hạt kefir dưới ảnh hưởng của các tỷ
lệ chất bảo vệ ở -150C theo thời gian bảo quản ............................................................. 80

x

con người. Ngoài việc cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu, thúc đẩy tiêu hóa, tăng
1


Đồ án tốt nghiệp

cường sức đề kháng của cơ thể nó còn được biết đến với tính chất kháng một số bệnh:
ung thư, chống lão hoá và tăng cường tiêu hoá. Khác với sữa chua thông thường, kefir
là sản phẩm vừa lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic ưa ấm, vừa lên men rượu nhờ
nấm men. Kefir có khả năng lên men rất mạnh và có thể lên men liên tục trong nhiều
lần. Ngoài ra, hạt kefir còn có khả năng lên men được nhiều loại nước trái cây và là
một nguồn nguyên liệu rất tốt để sản xuất acid lactic ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như: thực phẩm, y học.
Từ năm 1992, bụt giấm đã du nhập vào Việt Nam và được đỡ đầu bởi nhà khoa
học Mai Thi Tấn. Đài hoa bụt giấm là một loại dược liệu rất có lợi cho sức khỏe. Tính
theo hàm lượng chất khô đài hoa bụt giấm chứa khoảng 1,5% anthocyanin, axit hữu cơ
khoảng 15 – 30%, các vitamin A, B1, B2, C, E, F và nhiều loại khoáng chất như sắt,
đồng, canxi, magie, kẽm… Đài hoa bụt giấm chứa một loại chất chống oxy hóa rất
hiếm là flavonoid lên tới 12%.
Các sản phẩm sữa chua thông thường chỉ có khả năng ức chế một số chủng vi
khuẩn và phổ ức chế hẹp do đó để khắc phục những hạn chế này luận văn sẽ nghiên
cứu kết hợp sữa kefir và bụt giấm để tạo ra sản phẩm sữa chua kefir bụt giấm nhằm
mục đích hỗ trợ kháng khuẩn, kéo dài thời gian bảo quản và làm đa dạng phong phú
cho sản phẩm kefir đồng thời tạo ra một loại kháng sinh tự nhiên góp phần giảm thiểu
tình trạng kháng kháng sinh hiện nay. Với ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn nêu trên
chúng tôi thực hiện đề tài.
“Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước từ hoa bụt giấm
(Hibiscus sabdariffa L) và ứng dụng trong sản xuất sữa chua kefir” đề tài này được
thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường,
Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh.

thành phẩm.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về bụt giấm

1.1.1. Tên gọi và phân loại
Tên khoa học: Hibiscus Sabdariffa Linn
Tên tiếng anh: Roselle
Tên thường gọi: Atiso đỏ, bụp giấm, hoa vô thường, hoa lạc thần, mai côi gia,
đay nhật, lạc tế quỳ.
1.1.2. Phân loại thưc vật
Theo phân loại thực vật học, cây bụt giấm được sắp xếp theo trình tự
Giới (kingdom)

: Thực vật (Plantae)

(Không được xếp hạng)

: Cây hạt kín (Angiosperm)

(Không được xếp hạng)

: Eudicots

trắng. Quả nang hình trứng, có lông thô mang đài màu đỏ sáng tồn tại bao quanh quả.
Chu kì sinh trưởng và phát triển của cây bụt giấm từ 4 - 6 tháng. Cây ưa sáng,
chịu hạn, có thể trồng ở đất đồi xấu, khô cằn. Bụt giấm được nhân giống từ hạt, hạt
được gieo vào đầu mùa mưa và có thể thu hoặch sau 4- 6 tháng.
4


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1 Cây và đài hoa bụt giấm
1.1.4. Phân bố
Cây bụt giấm có nguồn gốc ở Trung Mỹ và Bắc Phi, sau lan sang Ấn Độ,
Malaysia, Philippin, Indonexia và Thái Lan.
Ở nước ta, cây trồng thử nghiệm để phủ đất trống, đồi trọc cho kết quả ở Hà
Tây, Bắc Giang, Thái Nguyên, Ba Vì và một số tỉnh sau này như Bà Rịa Vũng Tàu,
Đồng Nai. Tuy nhiên, cây trồng thành công ở Việt Nam chủ yếu thuộc các tỉnh miền
trung, thích hợp với đất đồi núi và trung du.
1.1.5. Giá trị sử dụng của cây bụt giấm
Cây là một trong hơn 300 loài thuộc giống cây bông được biết đến trên thế giới.
Giống cây này có rất nhiều ứng dụng trong đời sống con người và xu hướng sử dụng
hiện nay như:
-

Trồng để làm cây hoa cảnh.

-

Che phủ đất, cây hoang dại có sức sống cao.

-

-

Sửa đổi những đột biến gen, ngăn ngừa ung thư.

-

Trích ly làm màu thực phẩm tự nhiên có tác dụng chống lão hóa bảo vệ tế
bào cơ thể.

-

Tăng cường chức năng tiêu hóa.

-

Kháng nấm, kháng khuẩn.

-

Nâng đỡ chức năng gan, mật.

-

Hạn chế sự béo phì do tích tụ mỡ trong máu, bảo vệ thành mạch.

Đông y cho rằng, cây bụt giấm có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh mát giải
khát, liễm phế, chi khái nên được sử dụng để điều trị các bệnh như sau:
-

Chữa bệnh gan mật, cao huyết áp: lấy đài hoa bụt giấm 9 – 15 gam, sắc hoặc

tài “Chiết xuất chất màu tự nhiên từ đài hoa Hibiscus sabdariffa để dùng trong y học,
thực phẩm và mỹ phẩm” và đề tài “Chiết xuất chất kháng sinh dược học trong Hibiscus
sabdariffa để làm thuốc chữa bệnh”. Sau một vài năm thực hiện, đề tài kết thúc nhưng
kết quả đạt được chưa đủ để đưa cây bụt giấm trồng ở những vùng đồi núi lên hạng vị
trí quan trọng. Một số nhà khoa học của trung tâm công nghệ thực vật – viện di truyền
nông nghiệp của Khoa Sinh Học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cũng đã nghiên
cứu và khẳng định được tác dụng dược học của cây bụt giấm.
Năm 1998 – 1999, Trần Thúy, viện trưởng viện y học dân tộc cổ truyền đã
nghiên cứu các chế phẩm từ bụt giấm để điều trị bệnh cho bệnh nhân. Nhưng với điều
kiện khó khăn và thiếu thốn việc tách chiết các hoạt chất trong bụt giấm để sử dụng
trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm hoặc dược phẩm chưa thành công. Một số nhà
nghiên cứu đã tìm tòi một hướng đi khác, chế biến đài hoa bụt giấm thành những sản
phẩm thực phẩm thông thường, dễ được người tiêu dùng chấp nhận.
Năm 2003, Đỗ Thị Thu Thùy có báo cáo nghiên cứu “Chất màu đỏ anthocyanin
trích từ đài hoa bụt giấm”.
Năm 2012, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Kim Pha, Nguyễn Bình Kha, Trịnh
Thanh Tâm, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Lạc Hồng đã nghiên cứu
“Nghiên cứu sản xuất nước giải khát từ đài hoa bụt giấm”.
1.1.7.2.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2002, Wong, P, YHM Salman và YB Cheman nghiên cứu về: Các đặc
điểm hóa lý của đài hoa bụt giấm, “Phsico-chemical charaeteristics of roselle (Hibiscus
sabdariffa)”
Năm 2010, Ugwu Arinze ở Nigeria nghiên cứu về: thành phần hóa học và
khoáng chất của dịch chiết từ đài hoa bụt giấm, “Chemical/Mineral composition of
water extracts of Hibiscus sabdariffa”

7

cacbon tetrachloride (Dahiru và cộng sự, 2003).

8


Đồ án tốt nghiệp

1.2.

Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật

1.2.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn
Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực
vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng
khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ
thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).
1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn
Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật đã
được nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá
trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đường truyền tín hiệu
(Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003).
Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và
một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi các cơ chế khác (Hình1.2).

Hình 1.2 Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004)

9


Đồ án tốt nghiệp

Phá vỡ vách tế bào

Phenolic acid

Cinnamic acid

?

Quinone

Hypericin

Liên kết bám dính, tạo
phức hợp với thành tế bào,
làm bất hoạt enzyme

Flavonoid
Flavone

Chrysin
-

Liên kết bám dính
Tạo phức hợp với thành tế
bào

Abyssinone

Khử hoạt tính enzyme
Ức chế phiên mã ngược


Terpenoid

-

Capsaicin

Phá vỡ vách tế bào

-

Berberine

Xen vào thành tế bào hoặc

Piperine

DNA

Mannose-

Khóa sự kết hợp của virus

specific

hoặc hấp phụ

Tinh dầu
Alkaloid



a.

Quinone
Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone. Chúng là những hợp chất

màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trưng cao.
Quinone có thể tạo phức không thay đổi với các amino acid ái nhân trong protein,
thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Do đó khả năng kháng
khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào,
polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền
không thể sử dụng được cho các vi sinh vật.
Người ta nhận thấy rằng anthraquinone được lấy từ một loài cây có nguồn gốc từ
Pakistan có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium
pseudodiphthericum và Pseudomonas aeruginosa có khả năng diệt khuẩn đối với
Pseudomonas pseudomalliae. Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả năng
chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và
ctv, 2010).
z

Quinone

Anthraquinone

Hypericin

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin
b.

Flavonoid