ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHẠM GIANG ANH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN VÀ TỶ LỆ LOÀI KÝ SINH TRÙNG
SỐT RÉT TẠI HUYỆN BÙ ĐĂNG, TỈNH BÌNH PHƯỚC BẰNG
KỸ THUẬT NHUỘM GIÊM SA VÀ NESTED - PCR
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Bệnh sốt rét 5
1.1.1. Định nghĩa 5
1.1.2. Ký sinh trùng sốt rét 5
1.1.3. Véc tơ truyền bệnh sốt rét 7
1.1.4. Vật chủ cảm thụ 8
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét 9
1.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới và Việt Nam 9
1.2.1. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới 9
1.2.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR ở Việt Nam 10
1.3. Tình hình sốt rét của Việt Nam và huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 12
1.3.1. Tình hình sốt rét của Việt Nam 12
1.3.2. Tình hình sốt rét của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 14
1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện KSTSR 15
1.4.1. Kỹ thuật nhuộm Giêm sa 15
1.4.2. Các test chẩn đoán nhanh (rapid diagnostic test) 18
1.4.3. Phương pháp nhuộm nhanh AO (Acridine Orange) 20
1.4.4. Phương pháp QBC (Quantative Buffy Coat) 20
1.4.5. Phươ
ng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20
1.5. Điều trị sốt rét 24
1.5.1. Nguyên tắc điều trị 24
1.5.2. Thuốc sốt rét theo nhóm người bệnh, chủng loại KSTSR 25
1.6. Các biện pháp phòng chống bệnh sốt rét 25
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

nhuộm Giêm sa 39
3.1.2. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật
Nested - PCR 45
3.1.3. So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR
trong việc phát hiện KSTSR 51
3.1.4. Kết quả giải trình tự 54
3.2. Bàn luận 55
3.2.1. Thành ph
ần, tỷ lệ loài KSTSR tại các điểm thu thập mẫu 55
3.2.2. Những trường hợp khác biệt kết quả giữa kỹ thuật Giêm sa
và kỹ thuật PCR 56
3.2.3. Phát hiện những ca nhiễm KSTSR hiếm gặp 59
3.2.4. Ký sinh trùng lạnh 60
3.2.5. Thay đổi về cơ cấu KSTSR của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
A. Kết luận 64
B. Kiến nghị 65
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA: Acid deoxyribonucleic
dNTPs: deoxynucleotide triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của KSTSR (Nguồn CDC) 7
Hình 1.2. Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17
Hình 1.3. Hình thể KSTSR P. knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17
Hình 1.4. Test chẩn đoánh nhanh 19
Hình 1.5. KSTSR phát hiện bằng phương pháp QBC 20
Hình 1.6. Chu trình phản ứng PCR 21
Hình 1.7. Sơ đồ kỹ thuật Nested - PCR xác định 4 loài KSTSR 22
Hình 1.8. Hình ảnh kết quả chạy điện di các loài KSTSR 23
Hình 3.1. Lam máu nhuộm Giêm sa 39
Hình 3.2. KSTSR P. falciparum trên lam máu nhuộm Giêm sa 40
Hình 3.3. KSTSR P. vivax trên lam máu nhuộm Giêm sa 40
Hình 3.4. KSTSR P. malariae trên lam máu nhuộm Giêm sa 41
Hình 3.5
. Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Giêm sa 42
Hình 3.6. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.7. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.8. Biểu đồ tần suất loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.9. Hình ảnh kết quả PCR những mẫu nhiễm P. falciparum 45
Hình 3.10. Hình ảnh kết quả PCR ca nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax
và P. ovale 46
Hình 3.11.
Hình ảnh kết quả PCR sản phẩm nhiễm đơn P. falciparum 46
Hình 3.12. Hình ảnh kết quả nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax, P. malariae
và nhiễm đơn P. vivax 47
Hình 3.13. Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Nested - PCR 48
Hình 3.14. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định
bằng Nested - PCR 49
Hình 3.15. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng kỹ thuật Nested - PCR 49

c góp phần cung cấp
số liệu cho việc hoạch định chính sách thuốc, cung cấp phác đồ điều trị cho từng
vùng, xây dựng bản đồ dịch tễ sốt rét và chiến lược phòng chống phù hợp.
Phương pháp soi lam máu nhuộm Giêm sa nhận biết hình thể đặc trưng của
các loài KSTSR dưới kính hiển vi là phương pháp xét nghiệm thường quy được áp
dụng rộng rãi trong mọi điều kiện thực địa cũng như
trong phòng thí nghiệm để
chẩn đoán, phát hiện KSTSR. Phương pháp này được xem như là “chuẩn vàng” 2
trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt rét
mới.
Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, một số phương pháp mới đã được
nghiên cứu, triển khai đã cung cấp những hướng nghiên cứu mới về KSTSR. Đặc
biệt, phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ngoài việc phát hiện được
KSTSR ở mật độ thấp (1KST/1μl máu) còn có khả
năng xác định các trường hợp
nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR giúp chẩn đoán, điều trị bệnh kịp thời; qua đó,
hạn chế tình trạng KST kháng thuốc sốt rét, cung cấp dẫn liệu về thành phần và tỷ lệ
loài KSTSR ứng dụng trong việc lập bản đồ dịch tễ sốt rét.
Tại Việt Nam, trong những thập niên qua, cùng với sự phát triển và những
thành tựu củ
a ngành y tế, công tác phòng chống sốt rét (PCSR) đã đạt được những
kết quả đáng kể, làm giảm số người mắc, số người chết và hạn chế bùng phát dịch
sốt rét, góp phần vào sự nghiệp chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân. Tuy nhiên,
do nước ta có điều kiện thuận lợi về địa lý, khí hậu cho sự phát triển của muỗi
Anopheles, trung gian truyền bệnh; cơ cấu KSTSR tại những vùng sốt rét lưu hành
có sự thay đổi; đồng thời, trình độ dân trí và ý thức phòng chống bệnh một số nơi
chưa cao, cộng với hiện tượng di dân tự do làm cho tình hình bệnh sốt rét vẫn còn

+ So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR trong việc
phát hiện KSTSR. 4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
chi, 19 loài ký sinh ở động vật có vú, khoảng 70 loài ký sinh ở chim và bò sát. Có 4
loài Plasmodium ký sinh ở người là: Plasmodium malariae (P. malariae) (Laveran
mô tả năm 1881), Plasmodium vivax (P. vivax) (Grassi, Feletti mô tả năm 1890),
Plasmodium falciparum (P. falciparum) (Welch mô tả 1897) và Plasmodium ovale
(P. ovale) (Stephens mô tả năm 1922)
[2]
.
Hiện nay, đã có báo cáo về KSTSR thứ 5 gây bệnh cho người là Plasmodium
knowlesi (P. knowlesi). P. knowlesi là loài ký sinh trùng sốt rét chỉ ký sinh ở khỉ,
tuy nhiên nhiều thông tin trên thế giới cũng như trong nước thời gian gần đây cho
thấy P. knowlesi có khả năng nhiễm bệnh ở người, thậm chí còn có nguy cơ lan
rộng và đe dọa tử vong.
6
Chu kỳ sinh học của KSTSR gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phát triển vô tính ở
người và giai đoạn phát triển hữu tính ở muỗi
[4], [13]
.
Giai đoạn phát triển vô tính
Thời kỳ trong gan hay còn gọi là giai đoạn tiền hồng cầu: Khi muỗi cái
Anopheles đốt người, tiêm thoa trùng vào da, thoa trùng chui qua mạch máu để luân
lưu trong máu. Sau 30 phút, toàn bộ thoa trùng chui vào gan, phát triển dần thành
thể phân liệt, thể phân liệt vỡ ra phóng thích các mảnh trùng trước khi xâm nhập
vào hồng cầu trong khoảng thời gian từ 7 - 12 ngày. Đối với P. vivax hoặc P. ovale,
ngoài sự phát triển tức thì của các thoa trùng, một số thoa trùng khác không phát
triển ngay thành th
ể phân liệt mà thành các thể ngủ (hypnozoites). Các thể này tiềm
tàng trong gan, có thể sau một vài tháng thậm chí có thể sau một hai năm mới phát

ủa môi trường bên ngoài. Nhiệt độ thích hợp nhất là 28
o
C - 30
o
C. Khi nhiệt độ bên
ngoài thấp hơn 16
o
C và cao hơn 45
o
C thì chu trình hữu tính không xảy ra.

Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của KSTSR (Nguồn CDC)

1.1.3. Véc tơ truyền bệnh sốt rét

Véc tơ truyền bệnh sốt rét cho người là muỗi cái Anopheles, họ Culicidae, có
khoảng 3.200 loài. Trên thế giới có khoảng trên 420 loài Anopheles khác nhau,
trong đó có khoảng 70 loài là véc tơ truyền bệnh cho người trong điều kiện tự
nhiên. Do các đặc điểm về địa lý, khí hậu và sinh thái môi trường mà ở mỗi vùng,
mỗi nước có các loài truyền bệnh sốt rét chính khác nhau
[10]
. 8
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về Anopheles trong những năm gần
đây cho thấy có 62 loài Anopheles
[15]
.
Trong đó, những véc tơ truyền bệnh chính ở Việt Nam là:

triển KSTSR trong cơ thể người. 9
Tất cả mọi người đều có thể mắc bệnh sốt rét nếu bị muỗi nhiễm KSTSR đốt.
Một số ngành nghề liên quan đến rừng núi (làm việc trong rừng, ngủ lại trong rừng)
thường có tỷ lệ mắc sốt rét cao.
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét
[10]

Có 2 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét:
- Yếu tố tự nhiên như khí hậu, sinh cảnh, môi trường… có tác động rất lớn
đến sự phát triển của bệnh sốt rét. Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh sản của Anopheles,
ảnh hưởng đến tiếp xúc giữa người và muỗi, đến quá trình phát triển của KSTSR
trong cơ thể muỗi. Các nghiên cứu cho thấy ở mỗ
i vùng địa lý có sự vượt trội của
từng loài KSTSR. Vùng nhiệt đới thuận lợi cho cả 4 loài P. falciparum, P. vivax, P.
malariae, P. ovale. Vùng ôn đới P. vivax chiếm ưu thế. Địa hình, thời tiết, khí hậu,
lượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm tác động lên quá trình phát triển, tới tuổi thọ và khả
năng hoạt động của muỗi, qua đó, ảnh hưởng đến mức độ lây truyền.
- Yếu tố về
kinh tế xã hội như biến động dân cư, chiến tranh, nghèo đói, cơ
sở hạ tầng thấp kém, nhà cửa tồi tàn có tác động trực tiếp đến lan truyền sốt rét, có
thể làm xảy ra dịch sốt rét, ảnh hưởng đến công tác PCSR.
Trình độ văn hóa thấp, nhận thức về bệnh sốt rét hạn chế, tập quán du canh
du cư, thói quen không ngủ màn cũng tác động lớn đến tình hình sốt rét của các địa
phương.
1.2. PHÂN BỐ VÀ CƠ CẤU KSTSR TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.2.1. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới
Có 4 loài KSTSR gây bệnh cho người: P. falciparum, P. vivax, P. malariae,

+ Lào: có 3 loài. P. falciparum 70 - 80%, P. vivax 19 - 25%, P. malariae
0,5 - 1%.
+ Campuchia: P. falciparum 88%, P. vivax 12%.
+ Malaysia: P. falciparum 75%, P. vivax 24%, P. malariae 1%.
+ Indonesia: phát hiện được cả 4 loài trong đó P. falciparum 84%, P. vivax
14%, P. malariae 2% và đã phát hiện được P. ovale.
+ Philippines: có đủ 4 loài, P. falciparum 85%, P. vivax 14%, P. malariae
1%, P. ovalae hiếm gặp.
1.2.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR
ở Việt Nam
Qua các cuộc điều tra sốt rét trước đây thì ở Việt Nam có 3 loại Plasmodium
là P. falciparum, P. vivax, P. malariae. Hiện nay, với kỹ thuật sinh học phân tử 11
PCR đã nghiên cứu, phát hiện P. ovale ở Việt Nam. Nhưng chủ yếu vẫn là 2 loại P.
falciparum và P. vivax, trong đó, P. falciparum chiếm 70 - 80%
[10]
.
Cơ cấu của các loài KSTSR thay đổi tùy theo từng vùng, từng mùa và cũng
thay đổi dưới sức ép của các biện pháp PCSR.
P. falciparum hiện diện nhiều ở vùng sốt rét lưu hành nặng (rừng núi, cao
nguyên, ven biển miền Nam từ Phan Thiết trở vào). Ở những vùng này, P.
falciparum thường chiếm từ 70% - 80% số KST.
P. vivax chiếm từ 18% - 27%, P. malariae từ 1% - 3%. P. vivax phân bố
nhiều hơn ở các vùng Duyên Hải miền Bắc, miền Trung và Nam Bộ.
Trong quá trình tiêu diệt sốt rét với các tác động của các biện pháp PCSR
quy mô thì P. falciparum giảm nhanh, P. vivax giảm chậm hơn, tương quan giữa 2
loại KST này có thay đổi. Sự giảm nhanh của P. falciparum vừa là kết quả, vừa là
tín hiệu nói lên công tác PCSR tiến triển tốt. Ngược lại, P. falciparum giảm chậm

.

Tại khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng, năm 2001, Lê Đức Đào và cộng sự áp
dụng kỹ thuật PCR khảo sát thành phần 4 loài KSTSR ở 3 tỉnh: Lâm Đồng, Bình
Phước và Đắk Lắk. Kết quả cho thấy sự tồn tại của cả 4 loài KSTSR và tỷ lệ nhiễm
phối hợp 2, 3 loài rất cao. Tại Lâm Đồng tỷ lệ nhiễm phối hợp là 41%, Bình Phước
22%, Đắk Lắk 36,5%.
- Tại Lâm Đồng: P. falciparum chiế
m 57,9%, P. vivax 33,7%, P. malariae
6,3%, P. ovale 2,1%.
- Tại Đắk Lắk: P. falciparum chiếm 52,4%, P. vivax 38,5%, P. malariae
6,3%, P. ovale 2,8%
[5]
.
1.3. TÌNH HÌNH SỐT RÉT CỦA VIỆT NAM VÀ HUYỆN BÙ ĐĂNG, TỈNH
BÌNH PHƯỚC
1.3.1. Tình hình sốt rét của Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng sốt rét lưu hành, là một trong những nước có nguy
cơ cao về bệnh sốt rét. Chương trình quốc gia “Tiêu diệt sốt rét” đã đạt được thành
tựu to lớn ở miền Bắc trong thời kỳ 1958 - 1975 và trên phạm vi cả nước từ sau
ngày giải phóng 1976 - 1980. Nhưng từ năm 1980 trở đi bệnh số
t rét đã quay trở lại
và ngày càng nghiêm trọng mà đỉnh cao là năm 1991, có hơn 1 triệu người mắc,
4.646 người chết, hơn 114 vụ dịch lớn xảy ra ở nhiều địa phương trong cả nước.
Cũng từ năm 1991, Việt Nam chuyển hẳn sang chiến lược “Phòng chống sốt rét” và
chính phủ đã đưa chương trình “Phòng chống sốt rét” thành một trong các chương
trình y tế quốc gia ưu tiên
[22]
.


SR
1 1 1 0 1 Trong 5 năm 2006 - 2010 đã có 59/63 tỉnh, thành (93,65%) không có dịch sốt
rét; 39/63 tỉnh, thành (61,9%) không có chết do sốt rét; 56/63 tỉnh, thành 5 năm liên
tiếp có tỷ lệ BNSR < 1,15/1000 dân (đạt 88,88%); 30/63 tỉnh, thành 5 năm liên tiếp
có tỷ lệ chết do SR < 0,3/100000 dân (đạt 47,61%) (Phụ lục 2).
Tình hình sốt rét hiện nay tương đối ổn định nhưng vẫn còn là mối đe dọa
sức khỏe đối với những người dân ở vùng sâu, vùng xa, vùng biên giới và đối với
dân di cư.
Tại Vi
ệt Nam, từ năm 2003, Chương trình quốc gia PCSR đã phân vùng dịch
tễ và can thiệp dựa vào các yếu tố về vùng địa lý, sinh cảnh, thảm thực vật rừng, khí
hậu, chỉ số bệnh nhân sốt rét, KSTSR và sự có mặt của muỗi truyền bệnh sốt rét.
Kết quả phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009 ở Việt Nam có 5 vùng như
sau: vùng không có sốt rét lưu hành, vùng nguy cơ sốt rét quay trở lại, vùng sốt rét
l
ưu hành nhẹ, vùng sốt rét lưu hành vừa, vùng sốt rét lưu hành nặng
[10], [18]
.

14
Bảng 1.2. Các vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009
Vùng dịch tễ sốt rét Số xã Dân số Tỉ lệ % dân số
Vùng I:
Không có SRLH

dài biên giới là 240km, tình trạng di biến động dân, giao lưu biên giới khó kiểm
soát. 15
Tỷ lệ KSTSR tại Bình Phước năm 2010 tổng số là 2.781, trong đó P.
falciparum có 1.869 ca (chiếm 67,2%), P. vivax có 873 ca (chiếm 31,4%) và nhiễm
phối hợp có 96 ca (chiếm 1,4%)
[20]
.
Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước với địa hình thuộc vùng đồi cao nguyên.
Nông nghiệp chủ yếu trồng cây sắn, cây cao su và cây điều. Khí hậu chia làm 2 mùa
rõ rệt mùa mưa và mùa khô. Mùa mưa từ tháng 8 đến tháng 11, mùa khô từ tháng
12 đến tháng 8 năm sau. Nhiệt độ trung bình trên 20
o
C.
Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước là một trong những “điểm nóng” về sốt rét
của khu vực. Nên mặc dù được nhà nước quan tâm đầu tư cho công tác PCSR
nhưng bệnh sốt rét vẫn diễn biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng trong những
năm gần đây.
Bảng 1.3. Tình hình sốt rét tại huyện Bù Đăng giai đoạn 2008 - 2010
Năm
Bệnh
nhân sốt
rét
Chết do
sốt rét
Ký sinh trùng
Tổng số P. falciparum P. vivax Phối hợp
2008 468 1 389 326 (83,8%) 62 1

để phát hiện và định loạ
i KSTSR, giọt mỏng dùng để xác định chủng loại KST khi
có nghi ngờ. Kết quả trả lời bao gồm: chủng loại KST, các thể KST tìm thấy trong
máu cùng với mật độ của chúng.

17

Hình 1.2. Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi Hình 1.3. Hình thể KSTSR P. knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi
Đặc điểm hình thể hồng cầu bị ký sinh

Hồng cầu bị P. falciparum ký sinh kích thước gần như bình thường, không
trương to. Hồng cầu màu hơi nhạt, ở rìa hồng cầu sẫm màu hơn. Trên hồng cầu có
thể thấy những hạt Maurer: hạt to, thưa thớt bắt màu đỏ (kích thước khoảng 1µm)
hoặc có thể thấy vết Maurer.
Hồng cầu bị P. vivax ký sinh trương to, hình bầu dục hoặc méo mó, nhạt màu
và có nhiều hạt Schuffner: là những h
ạt nhỏ, nhiều lấm tấm bắt màu đỏ, rải rác khắp
hồng cầu.
Hồng cầu bị P. malariae ký sinh không thay đổi kích thước, đôi khi còn nhỏ
hơn hồng cầu bình thường và có xuất hiện các chấm hồng nhạt Zieman.