Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện. Các số liệu
và kết quả trong luận văn là trung thực. Tôi cam đoan rằng các thông tin, trích dẫn
của luận văn đó được chỉ dẫn nguồn gốc và nghiên cứu đầy đủ. Nếu sai tôi hoàn
toàn chịu trách nhiệm.
Sinh viên
Nguyễn Thị Bảo Ngọc

LỜI CẢM ƠN
1

Để hoàn thành được luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
1

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo, kĩ thuật viên phòng thí
nghiệm - Khoa Nông học - Trung tâm Công nghệ sinh học - Trường Đại học
Nông - Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập tốt nghiệp tại trường.

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

IBA

: Indole-3-butyric acid

Kineti

: Furfurylaminopurine

LSD

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and skoog

NAA


Nguồn tài nguyên cây thuốc của Việt Nam rất phong phú, đa dạng và
có nhiều cây thuốc quý. Trong số đó có cây Đinh lăng.
Đinh lăng (PolysciasfruticosaL.Harms) có tác dụng hồi phục sức khỏe,
chống stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm rối loạn tiền đình,
phòng chống nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ siêu cao. Đinh lăng còn có
tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa trên tác dụng
hạ cholesterol toàn phần và lipid toàn phần trong huyết thanh (Nguyễn Thị
Thu Hương và cs, 2001).
Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh
lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng
lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi
làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm
Hoàng Hộ, 1999).
Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng
thuốc sắc, rượu ngâm hoặc bột khô để chữa ho, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm
thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè. Đặc biệt
rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để
chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực. Trong dân gian, ngoài
công dụng ăn gỏi cá có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thông tiểu,
thông sữa, kiết lỵ nặng. Tại Ấn Độ, theo K. M. Naikairai, Đinh lăng được
dùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004)
Trong Đinh lăng có 2 hợp chất chính và quan trọng là polyacetylen và
saponin (Vo et al., 1998). Hợp chất saponin, đặc biệt là triterpen có tác dụng tích
cực chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm. Hợp chất
polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng

5
Khóa luận tốt nghiệp

5

vitro để nhân nhanh giống cây Đinh lăng lá nhỏ.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2
0.1% đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn.
6
Khóa luận tốt nghiệp

6
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine (kinetine,BA)
đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ .
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine thích hợp nhất
kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Đinh lăng lá nhỏ.
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng NAA đến khả năng ra rễ
của chồi cây Đinh lăng lá nhỏ.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp tài liệu khoa học về ảnh
hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp in vitro.
Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kỹ thuật nhân
giống cây dược liệu nói chung và cây Đinh lăng nói riêng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu thành công sẽ bổ sung tài liệu tham khảo phục vụ

- Ngành: Magnoliophyta - Ngành Mộc lan
- Giới: Plantae - Giới thực vật
Chi Polyscias có gần 100 loài, phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt,
nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, có 7 loài, đều là cây trồng (Đỗ
Huy Bích và cs, 2004).
1.2. Đặc điểm sinh thái
Đinh lăng là loại cây chịu hạn, không ưa nước, phát triển tốt ở vùng
đất, tơi xốp có độ ẩm trung bình (Nguyễn Bá Hoạt, 2005) . Cây cũng có thể
chịu bóng râm, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất
ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được theo kiểu cây cảnh bonsai ((Đỗ
Huy Bích và cs, 2004). Đinh lăng sinh trưởng mạnh vào mùa xuân hè, ra hoa
và quả vào tháng 4 đến tháng 7. Cây trồng ở các tỉnh phía bắc có hiện tượng
tàn lụi vào mùa đông do khí hậu lạnh, thường trồng bằng cành sau 2 đến 3
năm thì cây có quả, hạt. Đinh lăng có khả năng tái sinh dinh dưỡng mạnh
nhưng chưa quan sát được cây con mọc từ hạt. Cây thường được trồng bằng
8
Khóa luận tốt nghiệp

8
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

cách giâm cành, cây được 4 đến 5 tuổi trở lên sẽ cho nhiều hoạt chất nhất.
(Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
1.3. Đặc điểm hình thái
Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harm.) thuộc họ Ngũ gia bì


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

• Quả
Quả dẹt, hình trứng rộng, màu tráng bạc, dài 4 - 5 mm, rộng 3 mm và
dày 1,5 - 2 mm, có vòi tồn tại. Hạt hình thận và hình khối 3 cạnh màu trắng,
kích thước 1 - 3 mm, vỏ hạt lồi lõm. Cây ra hoa, quả vào tháng 4 đến tháng 7
(Từ điển bách khoa dược học, 1999).
• Rễ
Rễ hình củ cà rốt, cong queo, dài 15 - 30 cm, đường kính 0,5 - 2,5
cm, đầu trên to, phía dưới thuôn nhỏ. Mặt ngoài màu trắng xám, có nhiếu nếp
nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ còn
sót lại. Thường hợp thành một bó rễ củ, thể chất cứng giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻ
lởm chởm, mặt cắt ngang màu vàng, gỗ chiếm 2/3 bán kính, các tia ruột từ
giữa tỏa ra, mùi thơm nhẹ, vị hơi ngọt (Từ điển bách khoa dược học, 1999).
Trong tự nhiên, dễ có sự nhầm lẫn giữa các cây cùng tên Đinh lăng
nhưng không được dùng làm thuốc như:
+ Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Baill.): Lá thường chỉ có 3
lá chét trên một cuống dài, lá chét hình tròn, đầu tù.
+ Đinh lăng lá to hay Đinh lăng lá ráng (Polyscias ilicifolia (Merr.)
Baill.): Lá kép, có 11 - 13 lá chét, lá chét hình mác có răng cưa to và sâu.
+ Đinh lăng trổ hay Đinh lăng viền bạc (Polyscias guilfoylei Baill.): Lá
kép có 7 lá chét, lá chét thường có viền trắng. Loại này lại có 2 thứ là:
- Polyscias guilfoylei Baill. var. laciniata Baill.
- Polyscias guilfoylei Baill. var. victoriae Baill.
1.4. Thành phần hóa học
Vỏ, rễ và lá Đinh lăng chứa saponin, alkaloit, các vitamin B1, B2, B6,
C, 20 axit amin, glycosit, phytosterol, tanin, axit hữu cơ, tinh dầu, nhiều

(Trần Công Luận và cs, Công trình nghiên cứu khoa học 1987-2000).
1.5. Tình hình sử dụng Đinh lăng ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ đảo Polynésie ở Thái Bình Dương.
Hiện nay, cây được trồng rộng rãi ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào,
Việt Nam, Trung Quốc (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Tại Ấn Độ, theo Naikarai K.M., Đinh lăng được dùng làm thuốc săn da
và trị sốt. Tại Trung Quốc, Đinh lăng được sử dụng để tăng cường sức khỏe,
chữa chứng mất ngủ, chữa ho, dị ứng… Ở Campuchia, người ta còn dùng lá
phối hợp với các loại thuốc khác làm bột hạ nhiệt và cũng dùng làm thuốc
giảm đau.
11
Khóa luận tốt nghiệp

11
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

1.5.2. Ở Việt Nam
Đinh lăng đã xuất hiện từ rất lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ
biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện… để làm cảnh, làm thuốc
và rau gia vị (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Trong y học cổ truyền, Đinh lăng được sử dụng nhiều trong điều trị các
căn bệnh như ho ra máu, dị ứng, mẩn ngứa, làm lành vết thương, lợi tiểu, kiết
lị nặng, tăng sức dẻo dai của cơ thể… Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc
trải giường cho trẻ em nằm phòng bệnh kinh giật. Phụ nữ sau khi sinh uống


người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông cũng đã
tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây lá mầm như: Erythronium,
Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại
thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà
thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh
trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh
trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại,
mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000)
.
Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào
thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi
trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men.
Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các
vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999).
Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh
trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và
cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi
và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999). Cũng trong thời
gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA,
2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và
NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật
mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005).
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào
môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy chế phẩm này có
tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt. Một năm sau, Skoog và
cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và
đặt tên là kinetin. Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác
13

1.6.2. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy in vitro các nguyên
liệu như đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có kích thước phù
hợp được nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng và môi trường
thích hợp để tạo thành mô hay cây hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ và cs,2009).
Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có
thể tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiện quanh năm không

14
Khóa luận tốt nghiệp

14
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây
ban đầu (Nguyễn Ngọc Dung, 1998), (Ngô Ứng Long, 1985).
1.6.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy
Trong nhiều thập kỷ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển
mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói đây là công cụ cần thiết
trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của nghành sinh học
Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus,
nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần... con người đã thúc đẩy thực
vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Điều này sẽ
góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của
cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới vào sản xuất với quy mô

Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất được từ nuôi cấy mô dịch
huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung các kỹ thuật nhân giống vô
tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng... một kỹ thuật
tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực kỳ cao
và có tiềm năng công nghiệp hóa (Lê Trần Bình, 1997).
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là
mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ
chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền - đột biến, sinh lý sinh dưỡng ở
các tế bào thực vật và nhiều đề sinh học khác…(Vũ Văn Vụ và cs, 2008).
1.6.4. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành
nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho
rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát
triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào
đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có
nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết
của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó
có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơ
thể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm
năng tổng hợp những kiểu protein – enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi
trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng
cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường. Khả năng đó của tế bào được gọi
là tính toàn năng của tế bào thực vật” (Nguyễn Đức Thành, 2002).

16
Khóa luận tốt nghiệp

16

17
Khóa luận tốt nghiệp

17
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

thực vật xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực
vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.
Trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2002).
1.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.7.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân
giống in vitro. Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết.
Đối với Đinh lăng, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro có
thể là chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng, hoặc đoạn thân non. Các vật liệu này cần
được đảm bảo vô trùng trước khi tiến hành nuôi cấy in vitro. Phương pháp vô
trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất hóa học. Đối với
các thí nghiệm nuôi cấy Đinh lăng in vitro, tôi sử dụng đỉnh sinh trưởng đã
qua khử trùng để phục vụ cho việc nhân giống in vitro.
1.7.2. Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và
mô trong quá trình nuôi cấy in vitro. Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là
ba điều kiện có vai trò quan trọng nhất (Nguyễn Đức Thành, 2002).
Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và
các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn

nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên
cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu
một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thục vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác được sử dụng cho
mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ
biến như MS, WP. Ví dụ môi trường MS ( Murashige & Skoog, 1962) là môi
trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi
trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm. Hay môi trường
Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử
dụng trong tách và nuôi tế bào trần.
Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng
đều gồm một số thành phần cơ bản sau (Lê Trần Bình, 1997):
- Các muối khoáng đa lượng vi lượng
- Nguồn cacbon
- Các vitamin và aminoacid
- Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường
- Các chất điều hòa sinh trưởng
19
Khóa luận tốt nghiệp

19
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

1.7.3.1. Nguồn cacbon


Nồng độ µM/l
15 – 100
6 – 100
15 – 30
0,04 - 0,08
0,0007 - 1,0
0,1 - 0,4
2,5 - 20,0

1.7.3.3. Nhóm nguyên tố đa lượng
Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K,
Mg, Ca, Na, S, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Các nguyên tố này có
chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với
môi trường và xây dựng nên thành tế bào, môi trường nhiều nito thích hợp
cho việc hình thành chồi, với môi trường nhiều kali sẽ giúp cho quá trình trao
đổi chất diễn ra mạnh mẽ (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
20
Khóa luận tốt nghiệp

20
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

1.7.3.4. Vitamin
Do các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được

sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan khác như: Nước dừa, khoai tây, chuối,
dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu
cơ, đường, Myo – inositol và các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit của
Cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành
phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực
đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009).
1.7.3.6. Các chất làm đông cứng môi trường
21
Khóa luận tốt nghiệp

21
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại để
tạo thành giá thể cho mẫu phát triển như agar: Dây là một loại polysaccharid
làm từ rong biển và có khả năng ngậm nước cao, ở 80 0C Agar ngậm nước và
tồn tại ở trạng thái lỏng, còn ở dưới 40 0C nó tồn tại ở trạng thái rắn. Trong
môi trường có tính axit cao, khả năng đông đặc của agar giảm. Nồng độ
thường sử dụng 5-8g/l (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.3.7. Các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở
thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất
này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức
năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo
và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng

trong nuôi cấy mô gọi là kinetin (6 - furfuryl - aminopurin - C 10H 9N 5O).
Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách được xytokinin tự nhiên ở dạng
kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin. Sau đó người
ta đã phát hiện xytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là
một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây.
Trong các loại xytokinin thì 3 loại sau đây là phổ biến nhất: Kinetin (6 furfuryl - aminopurin), 6 - benzin - aminopurin và Hiện nay người ta đã phát
hiện ra nhiều loại xytokinin trong các bộ phận đang sinh trưởng của cây.
Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng xytokinin được hình thành chủ yếu trong
hệ thống rễ. Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có
khả năng tổng hợp xytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh....
Người ta cũng đã phát hiện ra kinetin là loại xytokinin có nhiều ở trong
nước dừa. Xytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có
thể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc. Xytokinin có thể ở dạng tự do và
dạng liên kết tương tự như các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân
giải dưới tác dụng của enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các xytokinin
tổng hợp được sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin.
Vai trò đặc trưng của xytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ.
Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên
nhân là do xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và
protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình
thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi.
Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa
rễ) và xytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát
sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn. Nếu tỷ
23
Khóa luận tốt nghiệp

23
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của
cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hormon thực vật. Ethylen thường
được sử dụng để làm chính quả như ở chuối, hồng, hồng xiêm... làm ra hoa
24
Khóa luận tốt nghiệp

24
Nguyễn Thị Bảo Ngọc - D - CNSH 4A


Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Khoa Nông học

đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào. Đối với cà chua
trong điều kiện nồng độ ethylen cáo xẽ kéo dài khoảng ra rễ ở thân cây...
Nhóm Axit absixic
Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng
đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây
ngăn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein.
Nhóm Gibberellin
Giberelin được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà
khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp trong
các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có tác
dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng
cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy.
GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Trần Thị Lệ và cs, 2008).
1.7.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo (PGS.TS. Ngô Xuân Bình và cs, 2003): Trong nuôi cấy mô, tế
bào gồm 5 giao đoạn sau: