ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chủ đề:
CHẨN ĐOÁN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT
BẢN (JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS)
BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMP (LOOP-
MEDIATED ISOLATHERMAL
AMPLIFICATION)
Nhóm thực hiện: Giáo viên hướng dẫn:
Nhóm 3 PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 10/2009
MỤC LỤC
I. Đặt vấn đề
II. Tổng quan tài liệu
1. Định nghĩa bệnh VNNB
2. Virus VNNB
3. Phân bố virus VNNB
4. Chu trình lây nhiễm của virus VNNB
5. Đặc điểm bệnh VNNB
6. Giới thiệu kỹ thuật LAMP
a. Khái niệm kỹ thuật LAMP
b. Thiết kế mồi cho LAMP
c. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP
d. RT-LAMP
e. LAMP phát hiện SNP
f. Đọc kết quả
III. Vật liệu và Phương pháp
1. Định tính virus VNNB
a. Vật liệu

Vì hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB và người bị bệnh
VNNB có nguy có tử vong cao, nếu có điều trị khỏi bệnh thì cũng để lại
những di chứng hết sức nặng nề về thần kinh. Do đó, để hạn chế những hậu
quả do bệnh VNNB đem lại cần sử dụng kỹ thuật gene để chẩn đoán phát
hiện sớm virus VNNB sớm ngay khi virus mới xâm nhâp vào cơ thể hay
trong thời gian ủ bệnh.
II. Tổng quan tài liệu
1. Định nghĩa bệnh VNNB
Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây ra
bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần
kinh, có tên là virút viêm não Nhật Bản. Virút lây truyền qua người nhờ
trung gian của loại côn trùng tiết túc là muỗi. Bệnh có thể xảy ra rải rác hay
thành dịch.
Tùy theo mức độ và vị trí bị tổn thương tại hệ thần kinh trung ương
(HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như:
viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối
hợp: viêm não màng não, viêm não màng não tủy sống (BS.Võ Công Khanh,
2007).
2. Virus VNNB
Virus VNNB được xếp vào giống Flavivirus, họ Flavivudae, được
tách từ họ Togavirudae. Hình cầu, nhân chứa ribonucleic acid (RNA), kích
thước 45 - 50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ
giàu chất lipid (hình 1).
Hình 1: virus VNNB
Cấu trúc kháng nguyên của virus VNNB B có liên quan mật thiết với
kháng nguyên của virus viêm não Murray Valley, virus viêm não West Nile,
virus viêm não Saint Louis. Do vậy, ba virus viêm não này được xếp vào
nhóm virus VNNB B (Phạm Sỹ Lăng – Nguyễn Thiện, 2004).
Hình 2:các chủng virus VNNB
3. phân bố của virus VNNB

0
C thì sự phát triển của virus
dừng lại. Đó là lý do tại sao mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa hai miền
Nam, Bắc Việt Nam. Tại Miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh,
tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5 - 6 - 7. Tại miền Nam, thời
tiết nóng bệnh rải rác quanh năm (BS. Võ Công Khanh, 2007).
b. Phân bố theo tuổi và giới tính
Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Ở những
vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh
nên tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2 - 10 tuổi, phần đông ở thể không
triệu chứng lâm sàng, số lượng trẻ có kháng thể đặc hiệu tăng theo tuổi nên
tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ lớn và người lớn. Người nước ngoài không phân
biệt tuổi tác nếu chưa có miễn dịch đặc biệu đều có thể mắc bệnh khi đến
vùng có VNNB lưu hành. Bệnh không liên quan tới giới tính tuy nhiên trong
thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ.
Tuy chu trình sinh thái của virus VNNB trong thiên nhiên không thay
đổi, nhưng tình hình dịch tễ có biến đổi trước tác động của con người, như
thay đổi lề lối canh tác và chăn nuôi, đô thị hóa, điều kiện kinh tế xã hội
được nâng cao, sử dụng thuốc diệt trừ côn trùng trong canh nông, và cuối
cùng là thuốc chủng ngừa VNNB đã được sử dụng (BS. Võ Công Khanh).
6. Giới thiệu kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)
a. Khái niệm kỹ thuật LAMP
LAMP là kỹ thuật nhân bản acid nucleic đơn giản, nhanh, đặc hiệu và
cho hiệu quả cao. LAMP được phát triển bởi công ty hóa chất Eiken, Nhật
Bản. nó sử dụng bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện 6 vùng
trình tự trên acid nucleic đích và quá trình phản ứng thực hiện ở nhiệt độ
không đổi từ 60
0
C – 65
0

mồi cho LAMP (Eikenchemical.com).
c. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP
sau khi DNA mẫu và các chất phản ứng được cho vào trong test tube
sẽ được đưa vào trong tủ ổn nhiệt và giữ nhiệt độ không đổi từ 60
0
C - 65
0
C.
Quá trình phản ứng bắt đầu qua các bước sau:
bước 1: DNA sợi đôi bị mất trạng thái cân bằng khi nhiệt độ đột ngột
lên 65
0
C nên sẽ bị tách ra thành hai sợi đơn DNA, một mồi gắn vào trình tự
bổ sung trên DNA đích bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung nhờ enzyme DNA
polymerase. Đối với kỹ thuật LAMP không cần bước biến tính DNA bằng
nhiệt như PCR mà dựa vào việc tạo sợi đơn dựa vào mồi (hình 6).
Hình 6: Bước 1 của kỹ thuật LAMP
Bước 2: DNA polymerase thực hiện phản ứng tổng hợp sợi DNA bổ
sung với sợi DNA đích, bắt đầu từ đầu 3’ của vùng F2 của FIP (hình 7).
Hình 7: Bước 2 của kỹ thuật LAMP
Bước 3: Primer F3 gắn vào vùng F3c và tổng hợp sợi bổ sung thay thế
vị trí và giải phóng sợi bổ sung chứa FIP (hình 8).
Hình 8: Bước 3 của kỹ thuật LAMP
Bước 4: Một sợi đôi DNA được tổng hợp từ primer F3 và sợi DNA
mẫu (hình 9).
Hình 9: Bước 4 của kỹ thuật LAMP
Bước 5: Sợi bổ sung gắn với primer FIP được giải phóng trở thành sợi
đơn nhờ phản ứng thế chỗ của primer F3 khi tổng hợp sợi bổ sung. Khi ở
dạng sợi đơn thì sợi này sẽ tạo thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ do sự bổ sung
của vùng F1 và F1c (hình 10).

C.
Các bước của kỹ thuật RT-LAMP tương tự như kỹ thuật LAMP cho
DNA, nhưng có thêm bước tạo cDNA từ RNA như hình 15.
Hình 15: Tổng hợp cDNA từ RNA
e. LAMP phát hiện SNP (single nucleotide polymorphis)
vì kỹ thuật LAMP có độ đặc hiệu cao nên chỉ có những trình tự DNA
đích có độ tương đồng ở mức từng nucleotide mới được khuếch đại khi sử
dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện các dạng SNP. Hơn nưa đặc điểm của
phản ứng khuếch đại của LAMP có thể sự khác nhau một nucleotide trong
chu trình khuếch đại cho cả sợi sene và anti-sene, và các dạng SNP có thể
được phát hiện dễ dang, nhanh chóng bằng sự khuếch đại DNA có chứa SNP
chỉ trong một phản ứng duy nhất. Phản ứng cho kết quả nhanh chỉ trong
khoảng 30 phút.
Đặc điểm của LAMP cho SNP:
 Sử dụng 4 primer được thiết kế để xác đinh 6 vùng trình tự trên
khuôn, chỉ có DNA đích bổ sung hoàn toàn mới được khuếch đại .
 Phản ứng đặc hiệu có thể phân biệt sự khác nhau một nucleotide.
⇒ Các SNP có thể được phát hiện chỉ trong một bước nhờ sự hiện diện
của sản phẩm khuếch đại.
Nguyên lý của LAMP cho SNP: Như hình 16, nguyên lý cơ bản khi
sử dụng primer cho dạng hoang dại (WT primer). Primer FIP và BIP được
thiết kế chứa một nucleotide SNP (trường hợp này là allen cho kiểu hoang
dại) ở đầu 5’. Sử dụng WT primer, khi mà DNA đích có allen WT, DNA
được tổng hợp nhờ sự tạo thành cấu trúc vòng đôi ở hai đầu. Nếu như DNA
đích có sự đột biến allen WT (MUT) thì sẽ không tạo ra DNA có cấu trúc
vòng kép ở hai đầu nên sự khuếch đại không xảy ra.
Hình 16: nguyên lý của LAMP cho SNP
f. Đọc kết quả
Kết quả sau khi khuếch đại bằng kỹ thuật LAMP có thể dùng để định
tính hoặc định lượng. Nếu chỉ cần định thì kết quả có thể đọc bằng mắt

được trữ lạnh ở -80
0
C nếu chưa tiến hành tách RNA ngay. Ngoài mẫu bệnh
phẩm thì còn cần phải chuẩn bị đối chứng âm, mẫu đối chứng âm này phải
được kiểm tra kỹ để loại bỏ sự xâm nhiễm virus VNNB hoặc các loài thân
thuộc từ bên ngoài. Đối chứng dương là virus được nuôi trên tế bào C6/36
(dòng tế bào của ấu trùng muỗi Aedes albopictus).
Các thành phần khác cho kỹ thuật RT-LAMP: Bst DNA polymerase
and AMV reverse transcriptase, dNTP, Tris-HCl (ph 8.8), KCl, MgSO
4
,
(NH
4
)
2
SO
4
, Tween 20, betaine.
b. phương pháp
Tách RNA: RNA của virus được tách từ 140µl dịch nổi của bình nuôi
virus VNNB (đối chứng dương), 140µl đối chứng âm và 140µl mẫu máu của
bệnh nhân sử dụng QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN, Đức) với quy
trình theo bộ kit. RNA được tách ra khỏi cột QIAspin có thể tích cuối cùng
100µl bao gồm cả dung dịch rửa và được trữ ở -70
0
C cho đến khi sử dụng.
Thực hiện phản ứng RT-LAMP: Tất cả thành phần phản ứng của RT-
LAMP có tổng thể tích phản ứng 25µl sử dụng Loopamp RNA amplification
kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Nhật Bản) với thành phần phản ứng
bao gồm:

-80
0
C nếu chưa dùng
Sử dụng ngay hay trữ ở
-70
0
C cho đến khi sử dụng
Sử dụng bộ kit Loopamp RNA amplification kit
(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Nhật Bản) để
thực hiện phản ứng khuếch đại ở 63
0
C trong 60
phút
Hình 20: Sơ đồ thực hiện của kỹ thuật RT-LAMP để chẩn đoán
VNNB
c. Đọc kết quả
Đọc kết quả trên bản điện di, kết quả là dương tính nếu trên bản điện
di có sự tạo thành vệt dài khi nhuộm với ethidium bromide, nếu không có sự
xuất hiện của sản phẩm khuếch đại là kết quả âm tính.
Hình 21: kết quả điện di trên gel Agarose 3% (mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6
dương tính; mẫu 7 âm tính với virus VNNB)
Đọc kết quả bằng mắt thường nhờ vào màu của test tube sau phản ứng
so với mẫu đối chứng âm (mẫu dương tính màu của SYBR Green chuyển
sang màu vàng, trong khi mẫu đối chứng âm vẫn giữ màu da cam). Hoặc có
thể đọc kết quả khuếch đại nhờ vào sự phát huỳnh quang của SYBR Green
dưới đèn UV (dương tính cho màu xanh).
Hình 22: đọc kết quả khuếch đại gene E của virus VNNB bằng mắt
thường và dưới tia UV
2. Định lượng virus VNNB
Nâng nhiệt độ lên 80

0
C
Ly trích RNA bằng bộ kit QIAamp viral
RNA mini kit (QIAGEN, Đức)
RNA được sử dụng ngay hoặc trữ
ở -70
0
C cho đến khi sử dụng
Thực hiện phản ứng khuếch đại các mẫu chuẩn
trong Loopamp Real Time turbidimeter để xác
định giá trị Tp
Xây dựng đường chuẩn dựa trên Tp và lượng
virus trong mẫu chuẩn
Hình 25: Các bước thực hiện của kỹ thuật Real Time RT-LAMP
IV. Kết luận
Như đã trình bày ở trên, kỹ thuật RT-LAMP nói riêng và kỹ thuật
LAMP nói chung là kỹ thuật hứa hẹn sẽ được phát triển rộng rãi cho việc
khuếch đại acid nucleic, cũng như chẩn đoán bệnh trực tiếp chỉ trong một
bước phản ứng. Đây có thể chính là kỹ thuật sẽ thay thế kỹ thuật PCR do
những ưu điểm của nó so với phản ứng PCR như: Nhanh (chỉ mất từ 30-60
phút), đặc hiệu, đơn giản, không cần máy móc đắt tiền…
RT-LAMP định tính và định lượng là kỹ thuật hiệu quả cho việc chẩn
đoán virus VNNB. Cần nghiên cứu sâu hơn để xây dựng một quy trình
chuẩn cho việc chẩn đoán virus VNNB.
V. Tài liệu tham khảo
- M. M. Parida, S. R. Santhosh, P. K. Dash, N. K. Tripathi, P. Saxena1,
Ambuj, A. K. Sahni1, P. V. Lakshmana Rao and Kouichi Morita, 2006;
development and evaluation of reverse transcription Loop mediated
isothermal amplification assay for rapid and Real-time detection of
japanese encephalitis virus.

gia súc và gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị.
- Viện kí sinh trùng sốt rét Quy Nhơn; Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét
bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- Wikipedia .com.vn
- Eikenchemical.com